一种姜状三七皂苷R1的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种姜状三七皂苷R1的制备方法，步骤如下：1）取人参皂苷Ro，加水溶解，用碱调节pH为8-13.8，在温度60-80℃的条件下进行。水解反应30-60min，反应结束后，冷却，pH值调节至7，得水解液；2）水解液过处理好的大孔吸附树脂柱，流速约0.5-1.0mL·min-1，弃去流出液，待水解液流至树脂层液面时，用水冲洗，洗至流出液不能发生Molish反应为止，然后用醇洗脱，收集醇洗脱液；3）将醇洗脱液和硅胶拌样，挥干醇，干法上正相硅胶柱，用氯仿：甲醇：水=75-55:25-45:10的下层液进行洗脱，分段收集样品，层析法检测，将含相同物质的样品进行合并，将各进行质谱检测，分子量为794的洗脱液为姜状三七皂苷R1，浓缩干燥即得姜状三七皂苷R1。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种三七皂苷R1的制备方法，特别涉及一种姜状三七皂苷R1的制备方法。
技术介绍
：人参皂苷（Ginsenoside，GS）是一种固醇类化合物，三萜皂苷，主要存在于人参属药材中，是人参的主要有效成分。人参皂苷都具有相似的基本结构，都含有由30个碳原子排列成四个环的甾烷类固醇核，它们依糖苷基架构的不同而被分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。现已明确知道的人参皂苷单体约有40余种；在人参中的含量在4%左右。其中研究最多且与肿瘤细胞凋亡最为相关的为Rg3与Rh2。众多研究表明，它具有较高的抗肿瘤活性，对正常细胞无毒副作用，与其他化疗药物（如顺铂）联合应用有协同作用。人参皂苷Ro（Ginsenoside-Ro）为齐墩果烷型人参皂苷，又被称为竹叶参Ⅴ，存在于人参，牛膝，竹叶参中，具有表面活性剂作用，对柴胡皂苷具有增溶的作用，能促进细胞增生，调节小鼠脾细胞Th1/Th2型细胞因子的产生，能促进毛发生长，还能抑制5α-还原酶和抗慢性心绞痛的作用。人参皂苷Ro结构存在糖苷键、酯苷键，易水解，所以人参皂苷Ro很不稳定（文献：刘宏群.人参中丙二酸单酰基和齐墩果酸型皂苷研究[D].中国农业科学院，2010）。人参皂苷Ro在加热条件下酯苷键易破坏，这种报道大多集中在定性分解及通过结构物质推测其产物。人参皂苷Ro在酸性条件下的水解难于控制，但人参皂苷Ro在碱性条件下的水解情况及水解产物尚无报道，本专利技术人研究了人参皂苷Ro在碱性条件下的稳定性，考察了不同温度不同pH值下人参皂苷Ro的水解情况，结果发现水解符合一级动力学反应。水解速率与水解温度和水解体系的pH值相关，相同的水解温度，pH值越高，水解越快；相同的pH值，温度越高水解越迅速。本专利技术人在研究人参皂苷Ro在碱性条件下的水解时意外的发现其水解产物中含有大量的姜状三七皂苷R1。姜状三七皂苷R1是一种已知物质，存在于姜状三七、竹叶参、牛膝、人参等药材中，具有降糖的特性，具有体外抗氧化能力等重要的价值。本专利技术由此开发出一种有用的用人参皂苷Ro制备姜状三七皂苷R1的制备方法。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种人参皂苷Ro碱水解得到姜状三七皂苷R1的制备方法，该制备的关键步骤是控制人参皂苷Ro的水解条件。本专利技术提供一种姜状三七皂苷R1的制备方法，所述方法，步骤如下：1）取人参皂苷Ro，加水溶解，用碱调节pH为8-13.8，在温度60-80℃的条件下进行水解反应30-60min，反应结束后，冷却，pH值调节至7，得水解液；2）水解液过处理好的大孔吸附树脂柱，优选AB-8、D101、Cleanert-PS树脂，最优选Cleanert-PS树脂，流速约0.5-1.0mL·min-1，弃去流出液，待水解液流至树脂层液面时，用水冲洗，洗至流出液不能发生Molish反应为止，然后用醇洗脱，优选甲醇或乙醇，最优选甲醇，收集醇洗脱液；3）将醇洗脱液和硅胶拌样，挥干醇，干法上正相硅胶柱，用氯仿：甲醇：水=75-55:25-45:10，优选65：35：10的下层液进行洗脱，分段收集样品，层析法检测，将含相同物质的样品进行合并，将各洗脱液进行质谱检测，分子量为794的物质为姜状三七皂苷R1洗脱液，浓缩干燥即得姜状三七皂苷R1。其中步骤1所述的碱是指甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，硼砂-氢氧化钠缓冲液，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，碳酸钠-氢氧化钠，磷酸氢二钠-氢氧化钠，氯化钾-氢氧化钠缓冲溶液或氢氧化钠缓冲溶液中的一种。优选磷酸氢二钠-氢氧化钠或氯化钾-氢氧化钠缓冲溶液调节PH至12-13。最优选用磷酸氢二钠-氢氧化钠调节PH至12或用氯化钾-氢氧化钠缓冲溶液调节PH至13；本专利技术优选的姜状三七皂苷R1制备方法，步骤如下：1）取30mg人参皂苷Ro，加入水溶解，磷酸氢二钠-氢氧化钠或氯化钾-氢氧化钠缓冲溶液调节PH至12-13，温度为70℃，搅拌水解45min，冷却，pH值调节至7，得到水解液；2）水解液过处理好的Cleanert-PS商品树脂柱（内径1cm，树脂床高约2cm；300μm，使用前用甲醇进行处理，再用水冲洗至无甲醇），流速约1.0mL·min-1，弃去流出液，待流至树脂层液面时，用水冲洗，洗至流出液不能发生Molish反应为止，然后用甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液。3）将甲醇洗脱液和硅胶拌样，挥干甲醇，干法上正相硅胶柱，用氯仿：甲醇：水=65：35：10（下层）进行洗脱，每4mL收集一次样品，点薄层板，将含相同物质的样品进行合并，将各洗脱液进行质谱检测，分子量为794的物质为姜状三七皂苷R1洗脱液，经过浓缩干燥得到18mg姜状三七皂苷R1。本申请姜状三七皂苷R1收率能够达到72%左右。本专利技术的方法是在研究人参皂苷Ro水解过程中获得的，该研究过程如下：1、仪器与试剂人参皂苷Ro对照品（天津马克生物科技有限公司，纯度为99%，批号：201310912）；氯仿为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），磷酸为色谱纯（天津市光复精细化工研究所），超纯水为实验室自制；Waters e2695高效液相色谱仪，Waters2489紫外检测器，岛津UFLC-IT-TOF，Bruker400M核磁共振仪，Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司），XS105梅特勒精密电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。2、方法与结果2.1人参皂苷Ro水解产物测定2.1.1色谱检测条件Waters Symmetry C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱程序：0～20min，30%乙腈～70%乙腈；流速：1mL/min；检测波长：203nm；柱温：30℃；进样量：10μL。人参皂苷Ro水解结果见图1。2.1.2工作曲线的绘制取人参皂苷Ro对照品适量，配制成质量浓度为0.60mg·mL-1的储备液，分别稀释5、10、20、40、80、160倍，分别吸取上述不同质量浓度的人参皂苷Ro对照品10μL进样，测定其峰面积。以人参皂苷Ro的进样质量为横坐标（X），色谱峰的峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得工作曲线方程Y＝3346 554X＋174 456，（r＝0.9999，n＝6），表明人参皂苷Ro在0.12mg·mL-1～3.75×10-3mg·mL-1的范围内呈良好的线性关系。2.1.3检测限的测定将人参皂苷Ro适量，配制成合适浓度，进样检测，当信噪比为3时，检测浓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种姜状三七皂苷R1的制备方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：1）取人参皂苷Ro，加水溶解，用碱调节pH为8‑13.8，在温度60‑80℃的条件下进行水解反应30‑60min，反应结束后，冷却，pH值调节至7，得水解液；2）水解液先过处理好的大孔吸附树脂柱，流速约0.5‑1.0mL·min‑1，弃去流出液，待水解液流至与树脂层相平时，用水冲洗，洗至流出液不能发生Molish反应为止，然后用醇洗脱，收集醇洗脱液；3）将醇洗脱液和硅胶拌样，挥干醇，干法上正相硅胶柱，用氯仿：甲醇：水=75‑55:25‑45:10的下层液进行洗脱，分段收集样品，层析法检测，将含相同物质的样品进行合并，将各洗脱液进行质谱检测，分子量为794的物质为姜状三七皂苷R1的洗脱液，浓缩干燥即得姜状三七皂苷R1。

【技术特征摘要】
1.一种姜状三七皂苷R1的制备方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
1）取人参皂苷Ro，加水溶解，用碱调节pH为8-13.8，在温度60-80℃的条件下
进行水解反应30-60min，反应结束后，冷却，pH值调节至7，得水解液；
2）水解液先过处理好的大孔吸附树脂柱，流速约0.5-1.0mL·min-1，弃去流出
液，待水解液流至与树脂层相平时，用水冲洗，洗至流出液不能发生Molish反
应为止，然后用醇洗脱，收集醇洗脱液；
3）将醇洗脱液和硅胶拌样，挥干醇，干法上正相硅胶柱，用氯仿：甲醇：水=
75-55:25-45:10的下层液进行洗脱，分段收集样品，层析法检测，将含相同物质
的样品进行合并，将各洗脱液进行质谱检测，分子量为794的物质为姜状三七皂
苷R1的洗脱液，浓缩干燥即得姜状三七皂苷R1。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤1所述的碱是指甘
氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，硼砂-氢氧化钠缓冲液，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，
碳酸钠-氢氧化钠，磷酸氢二钠-氢氧化钠，氯化钾-氢氧化钠缓冲溶液或氢
氧化钠缓冲溶液中的一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤1所述的碱调节PH
是指用磷酸氢二钠-氢氧化钠或氯化钾-氢氧化钠缓冲溶液调节PH至12-13。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤1所述的碱调节
PH是指用磷酸氢二钠-氢氧化钠调节PH至12或用氯化钾-氢氧化钠缓冲溶
液调节PH至13。
5....

【专利技术属性】
技术研发人员：叶正良，朱琼，李德坤，周大铮，鞠爱春，
申请(专利权)人：天津天士力之骄药业有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12