一种疟原虫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。具体地，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下游引物序列，且上游引物：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；下游引物：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’。在一种具体实施方式中，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针序列，且探针序列为：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’。本发明专利技术提供的试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性，利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫的有无，可为灵敏、早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于检测试剂盒
，具体涉及一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂 盒。
技术介绍
疟疾是全球最严重的由疟原虫引起的热带病之一，每年约有4亿人感染，其中大 部分发生在撒哈拉以南的非洲（恶性疟）和东南亚等国家（间日疟）。疟疾每年给非洲造 成的经济损失高达120亿美元。在针对疟疾的治疗过程中，病因的早期检测显得尤为的重 要，现在国内外成熟的商品化疟原虫检测试剂多为免疫学平台产品。 疟原虫的检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。 国内成熟产品中，外周血中核酸的提取，目前主要有三种方法：1)直接煮沸法：向 外周血中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速离心，上清即为模板。其优点是易于操作；缺点是 不能有效去除外周血中抑制PCR的因素，弱阳性经常无扩增。2)浓缩煮沸法：先将外周血 浓缩，再加裂解液，煮沸，高速离心，上清为模板，这种方法是目前国内临床通用的方法，其 优点是能部分去除"直接煮沸法"中无法去除的抑制性因素；缺点是不同厂家的浓缩效果不 一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到。看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，导 致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀的，使操作者无法确定吸弃杂质时会不 会把病毒一起吸弃，而导致病毒损失，导致成为假阴性。3)柱提取法：外周血通过裂解，过 柱后核酸吸附到膜上，通过两次洗涤，最后洗脱下来的为模板。这种方法相对前两种提取方 法而言，提取的核酸纯度大大提高，但步骤繁琐，时效性差。 临床上检测疟原虫的方法目前主要是免疫学方法，而基于实时荧光定量PCR技术 (探针法）对疟原虫进行检测的报导较少。实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的 一种核酸检测技术；它使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照 一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动 态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，实验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲 线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即Ct值）以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性 结果。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了荧光探针。探针发出的荧光信号被荧 光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。实验 结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果。因此，该技 术在靶多核苷酸样品的检测分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。 国内已有多种基于免疫学方法用于疟原虫检测的试剂盒，但暂无实时荧光定量 PCR技术检测疟原虫的试剂盒应用于临床检测中。已有的这些试剂盒所提供的疟原虫提 取和检测方法有很多不足之处：1)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本 时，需要经过多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集 不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本丢失验证，核酸提取效率低；2)检测灵敏度低，在 5000 C〇pieS/ml左右；3) -般没有预防物污染的措施；4)没有荧光归一化校正系统，结果判 定受主观因素影响较大；5)方法学时效性差且通量小。 因此，本领域需要研宄开发一种操作简便、耗时短、高效、安全可靠且检测灵敏度 高的疟原虫检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种疟原虫荧光定量PCR检测试剂盒，该试剂 盒包括用于检测的探针、用于扩增的上游引物以及下游引物、PCR缓冲液和DNA聚合酶。该 试剂盒操作简便，灵敏度高，并可预防PCR产物污染，具有很好的特异性、重复性和稳定性， 利用该试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测，可以确定血液样本中疟原虫有无，可为灵敏、 早期诊断是否被疟原虫感染提供可靠的实验证据。 因此，本专利技术提供一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR 检测的PCR反应液。具体地，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸扩增的上游引物和下 游引物序列，且所述上游引物的序列为：5' -CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3';所述下游引物 的序列为：5' -CCAGAACCCAAAGACITTGAITTC-3'。 在本专利技术的一种实施方式中，所述PCR反应液中包含用于靶多核苷酸检测的探针 序列，且所述探针序列为：5 ' -TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3 '。本专利技术中，所述探针的 羧基端用荧光素标记，并对羟基端用猝灭基团修饰，其中所述荧光素选自FAM、TET、JOE和 ffiX，所述猝灭基团选自BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2和BHQ3。优选所述荧光素为FAM，所述 猝灭基团为BHQ1。 本专利技术的试剂盒，因为采用了上述探针和上下游引物，所以具有很好的特异性和 灵敏性，应用本专利技术提供的试剂盒，可以对血液样本中的疟原虫进行快速、准确测定，特异 性好，能够检测出是否存在疟原虫感染。 在本专利技术的另一种实施方式中，所述试剂盒中还含有40~200mmol/L的参比染 料。本专利技术中，所述参比染料包括R0X参比染料（购自Roche公司）或其他适用于荧光定 量PCR的参比染料。加入R0X参比染料起到明显的归一化效果，对实验结果的重复性和稳 定性有明显改善。 本专利技术中，所述试剂盒中还包括酶混合液和疟原虫阴性对照，且所述酶混合液包 含浓度为1~5U/ y 1的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和浓度为0? 05~0? 2U/ y 1的尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG酶）。其中UNG酶具有降解含有dU的PCR产物的功能，利用UNG酶和PCR反 应液中的dUTP可以起到预防PCR产物污染的作用。在本专利技术的另一个实施例中，所述疟原 虫阴性对照为不含有疟原虫任意一种型别的灭活阴性外周血。 本专利技术的PCR反应中优选地包括PCR反应缓冲液。在本专利技术的一个实施例中，所 述10XPCR反应缓冲液包括pH7. 5的200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、30mmol/L氯化 镁、500mmol/L氯化钾、0. 2ml/100ml曲拉通、和10ml/100ml甲酰胺（各组分购自Sigma公 司 本专利技术还提供一种使用如上所述的试剂盒进行疟原虫荧光定量PCR检测的方法， 其包括：步骤K，将PCR反应液与酶混合液混合后制成PCR混合液；步骤L，将PCR混合液离 心处理，然后将经过离心处理的PCR混合液加入多个反应管，并向含有PCR混合液的反应 管中分别加入阴性对照或待测样本核酸，制成PCR反应样品，盖好管盖；步骤M，在荧光定量 PCR扩增仪上进行荧光PCR反应，检测并记录样品的扩增曲线与阈值线；步骤N，根据样品的 扩增曲线形状、扩增曲线与阈值线是否存在交点Ct，以及Ct值大小进行疟原虫分析；其中， 在步骤K中，PCR反应液的加入量为42~43 y 1/人份，酶混合液的加入量为1~2 y 1/人 份。 优选地，在步骤L中，每个反应管中阴性对照或待测样本核酸的加入量为3~ 5 y 1 〇【具体实施方式】 为使本专利技术更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本专利技术，这些实施例仅 起说明性作用，并不局限于本专利技术的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常 按照常规实验方法进行。 实施例1 本实施例提供一种疟原虫荧光定量PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疟原虫检测试剂盒，所述试剂盒中包括用于荧光定量PCR检测的PCR反应液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，邓中平，付亚成，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43