本发明专利技术公开了一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型。一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，提取DNA样本并进行PCR反应。本发明专利技术采用特异的MGB Blocker探针，NRAS和KRAS特异探针和引物，可检测肿瘤组织中DNA中RAS的突变；利用MGB Blocker阻滞NRAS和KRAS非特异性的扩增，提高灵敏度，大于ARMS的1%；可在循环肿瘤DNA中检测RAS的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
，尤其涉及一种用于全RAS突变检测的引物、探针 及检测试剂盒。
技术介绍
RAS基因家族是原癌基因，包括KRAS、NRAS和HRAS三个基因。KRAS基因定位于 人12号染色体，在人类肿瘤发生发展过程中起重要的作用。KRAS就像一种分子开关：正常 时能控制调控细胞生长的路径；发生异常如KRAS基因突变时，该基因永久活化，使细胞内 信号传导紊乱，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡从而发生癌变。KRAS基因突变发生在 肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。一般认为，KRAS基因状态不 会因治疗而发生变化。KRAS基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%， 胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。KRAS基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13 密码子（彡90%)，这些突变破坏了 KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于 持续活性状态（Fedorenko I V et al. Oncogene. 2012)。研宄表明检测KRAS基因突变，具 有重大的临床意义：KRAS基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗（Cetuximab)和帕尼 单抗（panitumumab)显示无效，只有KRAS野生型患者才被建议接受EGFR抑制剂的治疗（De Roock ff et al. Lancet Oncol. 2010;11:753-762. )〇 NRAS基因定位于人染色体lpl3. 2,基因全长12438bp，包含7个外显子，为原癌基 因。NRAS基因激活构成癌基因，其表达产物NRAS蛋白发生构型及功能的改变，活化状态的 Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使，造成细胞不可控制地增殖，恶变（D. Lambrechts et al. Journal of Clinical Oncology 2009: 4020)〇 NRAS基因改变主要为点突变，多发生在以第61密码子为代表的2、3、4外显 子。这些密码子编码的氨基酸是Ras蛋白和GTP酶活化蛋白（GAP)的作用位点。突变导致 RAS-GTP处于持续激活状态，引起细胞恶性增殖和转移。研宄表明：KRAS、NRAS、BRAF基因 同为野生型的患者cetuximab治疗效果较好，而NRAS基因突变患者无法从cetuximab治疗 中获益（Cecily P. Vaughn et al.GenesChromosomes and Cancer 2011:307-312，M. Di Bartolomeoet al. Targeted Oncology 2014:155-162. )〇 2015年NCCN指南明确指明患有侵润性结直肠癌的患者，在利用西妥昔和帕尼 单抗等EGFR单抗类药物时要进行全RAS检测（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for Colon Cancer. 2015)。目前临床上有的RAS检测产品只包括KRAS基因的 第12, 13密码子位点检测，检测位点比较少，已远远不能满足临床检测的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的：提供一种用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒，能检测 位点全，与现有技术的KRAS临床检测7种突变类型相比，检测KRAS 27种突变类型、NRAS 23种突变类型，很好的满足了临床的需求；利用了MGB Blocker封闭探针，提高了检测的灵 敏度，降低了非专一性结合，使得临床检测结果更好判读。 为了实现上述目的，本专利技术的技术方案是： 一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS 的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种 突变类型。 所述的KRAS外显子2的12，13外显子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以 及Blocker封闭的MGB探针具体为： K35-1B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3 SEQ ID N0.0 1 K35-3B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3 SEQ ID N0.0 2 K35-2B 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 SEQ ID N0.0 3 K34-2B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3 SEQ ID N0.0 4 K34-1B 5-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 SEQ ID N0.0 5 K34-3B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3 SEQ ID N0.0 6 K38-1B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID N0.0 7 K38-2B-1 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID N0.0 8 K38-3B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID N0.0 9 K37-1B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA-3 SEQ ID NO. 10 K37-2B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC-3 SEQ ID NO. 11 K37-3B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3 SEQ ID NO. 12 KWT34MGB 5-GGAGCTGGTGGCGTAG-3-MGB SEQ ID NO. 13 KR-R 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3 SEQ ID NO. 14 KR-Taqman FAM-5- CAAGAGTGCCTTGACGATAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 15 ; 所述的KRAS外显子3的61编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为： K181-1B 5-GATATTCTCGACACAGCAGGTA-3 SEQ ID NO. 16 K181-2B 5-ATATTCTCGACACAGCAGGTG-3 SEQ ID NO. 17 K182-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCC-3 SEQ ID NO. 18 K182-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCG-3 SEQ ID NO. 19 K182-3B 5-ATTCTCGACACAGCAGGTCT-3 SEQ ID NO. 20 K183-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAC-3 SEQ ID NO. 21 K183-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAT-3 SEQ ID NO. 22 K181R 5-AATACACAAAGAAAGCCCTCCC-3 SEQ ID NO. 23 K181WTMGB 5-GACACAGCAGGTCAAGAGG-3-MGB SEQ ID NO. 24 K181taqman FAM-5-AATGAGGGACCAGTACATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO. 25 ； 所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为： K3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于全RAS突变检测的引物、探针，其特征在于：包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型；所述的KRAS外显子2的12，13 外显子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：K35‑1B 5‑ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA‑3 SEQ ID NO.01K35‑3B 5‑ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT‑3 SEQ ID NO.02K35‑2B 5‑CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC‑3 SEQ ID NO.03K34‑2B 5‑AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC‑3 SEQ ID NO.04K34‑1B 5‑AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA‑3 SEQ ID NO.05K34‑3B 5‑AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT‑3 SEQ ID NO.06K38‑1B‑1 5‑TGGTGGTTGGAGCAGGTGA‑3 SEQ ID NO.07K38‑2B‑1 5‑GGTGGTTGGAGCAGGTGC‑3 SEQ ID NO.08K38‑3B‑1 5‑TGGTGGTTGGAGCAGGTGT‑3 SEQ ID NO.09K37‑1B 5‑TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA‑3 SEQ ID NO.10K37‑2B 5‑TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC‑3 SEQ ID NO.11K37‑3B 5‑TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT‑3 SEQ ID NO.12KWT34MGB 5‑GGAGCTGGTGGCGTAG‑3‑MGB SEQ ID NO.13KR‑R 5‑AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT‑3 SEQ ID NO.14KR‑Taqman FAM‑5‑ CAAGAGTGCCTTGACGATAC‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO.15；所述的KRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：K181‑1B 5‑GATATTCTCGACACAGCAGGTA‑3 SEQ ID NO.16K181‑2B 5‑ATATTCTCGACACAGCAGGTG‑3 SEQ ID NO.17K182‑1B 5‑TCTCGACACAGCAGGTCC‑3 SEQ ID NO.18K182‑2B 5‑TCTCGACACAGCAGGTCG‑3 SEQ ID NO.19K182‑3B 5‑ATTCTCGACACAGCAGGTCT‑3 SEQ ID NO.20K183‑1B 5‑TCTCGACACAGCAGGTCAC‑3 SEQ ID NO.21K183‑2B 5‑TCTCGACACAGCAGGTCAT‑3 SEQ ID NO.22K181R 5‑AATACACAAAGAAAGCCCTCCC‑3 SEQ ID NO.23K181WTMGB 5‑GACACAGCAGGTCAAGAGG‑3‑MGB SEQ ID NO.24K181taqman FAM‑5‑AATGAGGGACCAGTACATG‑3‑BHQ‑MGB SEQ ID NO.25；所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物,FAM‑MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：K349‑1B‑1 5‑ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG‑3 SEQ ID NO.26K350‑1B‑1 5‑ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG‑3 SEQ ID NO.27K351‑1B‑1 5‑CCTATGGT...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，
申请(专利权)人：上海允英医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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