本发明专利技术涉及一种花生果腐病病原菌的快速培养方法，属于花生病原菌培养方法技术领域。该方法以花生果腐病病果为材料，采用梯度稀释方法进行筛选并纯化，获得一种高致病性的花生果腐病病原菌Calonectria sp。用打孔法将纯化的致病性病原菌转接到液体培养基上富集培养12小时，之后将富集液涂布到平板上暗培养，2天后选取单菌落进行传代培养。如此对所得纯培养进行快速传代，选取经50次传代后致病性稳定的菌株进行保藏。对冻存菌，则采用先活化、后富集、之后扩大培养的方法，以满足花生抗病品种筛选短期内的大量需求。该方法能够有效缩短真菌性病原菌的培养时间，实现快速、大量培养，对花生果腐病抗病品种的选育及抗病机制的研究具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种花生果腐病病原菌的快速培养方法，属于花生病原菌培养方法
技术介绍
花生是我国重要的油料作物和经济作物，近年来花生果腐病, 俗称烂果病，在我国花生产区尤其是北方产区呈连年加重之势。果腐病是世界范围内普遍发生的花生土传病害之一, 危害严重, 难于治理, 一般发病田产量损失达15%左右, 重病田可致绝收。因此，果腐病病原菌的筛选、培养与致病性研究变得至关重要，它是花生果腐病抗病种质培育与抗病机制研究的重要基础，更是彻底实现花生果腐病防控的关键所在。由于花生果生长于土壤中的特殊性，使得花生果表面的附着菌与内生菌多样性很高，加大了病原菌的筛选难度。而大多数真菌本身存在生长周期较长、传代慢的特点，因此要想快速获得致病性稳定的纯培养物，必须采用合适的选择性培养方法并缩短其传代周期。另外，抗病花生种质的筛选、鉴定试验尤其是田间试验必须同期内接入大量的病原菌，这对病原菌的快速、大量繁殖技术又提出新要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种花生果腐病病原菌的快速培养方法，以达到短期内获得纯培养、致病性稳定的花生果腐病病原菌的目的，并实现快速、大量繁殖，以满足花生抗病种质筛选短期内的大量需求，对花生果腐病抗病品种的选育及抗病机制的研究具有重要意义。该方法包括如下步骤：采用打孔法将分离、纯化的高致病性花生果腐病病原菌Calonectria sp.转接到改良察氏液体培养基上富集培养，之后将富集液涂布到改良察氏培养基平板上暗培养。如此对所得纯培养进行快速传代，选取经50次传代后致病性稳定的菌株进行保藏。对冻存菌，则采用先活化、后富集、之后扩大培养的方法，实现快速、大量培养的目的，本专利技术还进一步提供了上述花生果腐病病原菌的快速培养方法的优选技术方案：作为优选，所述的花生果腐病病原菌是从花生果腐病病果中分离纯化获得，回接实验证明其具有高致病性，其ITS序列经比对与Calonectria morganii相似度为99%。该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No. 9807。作为优选，所述的花生果腐病病原菌的ITS序列为：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCATGTGAACATACCTGTTTCGTTCCCTCGGCGGTGTCCGGCAACGGCCCGCCAGAGGACCCAACAAACTCTTTTGAATTTTTCAGTATCTTCTGAGTGAAAAAAACAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCTTCGGGAGCTTGGTGTTGGGGATCGGCAGGGCGTCCTCCGGGTCGCGCCGTCCCCCAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGCTTCCTCTGCGTAGTAATACACCTCGCTCTGGAGTCTCGGTGCGGCCACGCCGTTAAACCCCCAACTATTTTCTGGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG。作为优选，所述的富集培养是用打孔法将5mm直径的纯培养菌斑转接到盛有20ml改良察氏液体培养基的三角瓶中，于摇床中以28℃、200rpm震荡12h。然后取1ml富集液涂布到改良察氏培养基平板上，至少做5个重复，暗培养2天，选取光滑、湿润、粘稠的菌落进行传代培养。作为优选，所述的改良察氏培养基配方为硝酸钠2g，磷酸氢二钾0.7g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，吐温0.5g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH为6.8。作为优选，所述的活化是指用接种针挑取甘油冻存菌到盛有5ml改良察氏液体培养基的10ml离心管中，于摇床中以28℃、200rpm震荡6-8h。作为优选，所述的富集是指将权利要求6中所述的5ml培养液移入盛有50ml改良察氏液体培养基的三角烧瓶中，28℃、200rpm震荡16h。作为优选，所述扩大培养是指取1.5ml权利要求7中所述的富集培养液，涂布于12cm直径的改良察氏培养基平板上，存留于超净工作台晾干后，按上述方法重复涂布两次，待晾干后置于培养箱28℃暗培养。具体实施方式下面通过具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案，本专利技术包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本专利技术所进行的不脱离本专利技术实质内容的改变，仍属于本专利技术的保护范围。实施例：在青岛莱西花生生产试验基地于收获期选取两个果腐病发病比较严重的材料花育38号和花育43号，分别选取5株烂果率在50%以上的植株。将5株植株的病果混合后装入封口袋中，用放有冰袋的泡沫盒低温保存带回实验室，并置于4℃冰箱保存备用。两个花生材料分别随机选取10个病果作为实验材料，并分别做两组重复实验。所有实验步骤均为无菌操作。病果用无菌水漂洗3-4次，去掉泥土与表面附着物，之后在超净工作台用无菌滤纸吸干水分并用灭过菌的剪刀剪碎。将剪碎后的病果至于盛有50ml改良马丁液体培养基的三角瓶中，于摇床中以28℃、200rpm震荡5h后，3000g离心5min，上清液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5进行梯度稀释后在平板上划线、分离。挑取形态不同的单菌落继续划线、纯化培养，直至获得纯培养物。采用传统的形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法（ITS序列测序）相结合，对纯培养的微生物进行鉴定分类。获得7株可能与花生果腐病相关的菌株，且在两个花生材料中均存在。对这7株菌分别进行致病性实验，结果表明其中的Calonectria sp.为高致病性菌株，对选取的四个感病花生品种可达到100%致病，田间接种实验烂果率达到30%以上。由于该菌在改良马丁培养基上生长缓慢，所以我们对其传代培养条件进行了改良。用打孔法将5mm直径的纯培养菌斑转接到盛有20ml改良察氏液体培养基的三角瓶中，于摇床中以28℃、200rpm震荡12h。然后取1ml富集液涂布到改良察氏培养基平板上，至少做5个重复，暗培养2天，选取光滑、湿润、粘稠的菌落进行传代培养。如此对所得纯培养进行快速传代，选取经50次传代后致病性稳定的菌株进行保藏。该菌属于丽赤壳属，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No. 9807。为满足花生抗病种质筛选试验短期内对病原菌的大量需求，针对该菌我们探索了实现快速、大量繁殖的方法。首先对冻存菌进行活化，用接种针挑取甘油冻存菌到盛有5ml改良察氏液体培养基的10ml离心管中，于摇床中以28℃、200rpm震荡6-8h；本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种花生果腐病病原菌的快速培养方法，其特征在于：采用打孔法将分离、纯化的高致病性花生果腐病病原菌Calonectria sp.转接到改良察氏液体培养基上富集培养，之后将富集液涂布到改良察氏培养基平板上暗培养；如此对所得纯培养进行快速传代，选取经50次传代后致病性稳定的菌株进行保藏；对冻存菌，则采用先活化、后富集、之后扩大培养的方法，实现快速、大量培养的目的，以满足花生抗病种质筛选短期内的大量需求。
【技术特征摘要】
1.一种花生果腐病病原菌的快速培养方法，其特征在于：采用打孔法将分离、纯化的高致病性花生果腐病病原菌Calonectria sp.转接到改良察氏液体培养基上富集培养，之后将富集液涂布到改良察氏培养基平板上暗培养；如此对所得纯培养进行快速传代，选取经50次传代后致病性稳定的菌株进行保藏；对冻存菌，则采用先活化、后富集、之后扩大培养的方法，实现快速、大量培养的目的，以满足花生抗病种质筛选短期内的大量需求。
2.如权利要求1所述的花生果腐病病原菌的快速培养方法，其特征在于：所述的花生果腐病病原菌是从花生果腐病病果中分离纯化获得，回接实验证明其具有高致病性，其ITS序列经比对与Calonectria morganii相似度为99%；该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No. 9807。
3.如权利要求2所述的花生果腐病病原菌的快速培养方法，其特征在于：所述的花生果腐病病原菌的ITS序列为：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCATGTGAACATACCTGTTTCGTTCCCTCGGCGGTGTCCGGCAACGGCCCGCCAGAGGACCCAACAAACTCTTTTGAATTTTTCAGTATCTTCTGAGTGAAAAAAACAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCTTCGGGAGCTTGGTGTTGGGGATCGGCAGGGCGTC...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈明娜，禹山林，王冕，潘丽娟，迟晓元，陈娜，王通，杨珍，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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