酰肼化pH敏感型聚合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，引发剂的投料量为0.02%-2%w/v，有机相和水相的体积比为1:10-10:1。本发明专利技术是由丙烯酸和丙酸甲酯共聚之后再经过水合肼肼化获得，其中酰肼的含量明显高于商品化酰肼材料中酰肼的含量，酰肼化pH敏感聚合物中的酰肼官能团和氧化糖肽中醛基的反应为共价结合，可以提供糖肽富集的特异性，酰肼化pH敏感聚合物在pH高于4的体系中为溶解状态，可以实现其官能团酰肼和糖肽的醛基反应的均相性，从而提高反应速率及糖肽富集效率。

【技术实现步骤摘要】
一种酰肼化pH敏感型聚合物及其制备方法
本专利技术涉及分析化学
，具体是一种酰肼化pH敏感型聚合物及其制备方法。
技术介绍
蛋白质的糖基化修饰是最广泛也是最重要的一种翻译后修饰过程。人体50％以上的蛋白质都带有糖基化修饰。糖基化几乎参与了所有重要的生命过程，例如受精、发育、免疫应答、细胞间识别及通讯等。同时也有研究表明，多种疾病的发生发展过程也都伴随着蛋白质的糖基化修饰或者蛋白质糖基化修饰的改变。因此，系统的定性定量鉴定、分析糖蛋白及其方法学的发展对于阐明糖基化修饰在各个生理过程和疾病发生发展中的作用及对于临床诊断标志物的发现显得尤为重要。但是由于复杂样本中蛋白浓度有相当广泛的动态范围，动态范围大约10-12个数量级，而绝大多数糖蛋白都是低丰度表达的蛋白，使得糖蛋白的鉴定效率大大降低；其次，白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白等高丰度蛋白的存在大大的抑制了低丰度蛋白的检测；此外，糖蛋白上的糖链具有高度的微观不均一性及多样性，因此质谱无法测定糖蛋白精确的化学结构及质量数，分散的质量数也导致检测灵敏度的降低。为了实现在复杂体系中规模化的糖蛋白分析，当前国际上的主要研究策略都是在质谱检测前，先对糖蛋白或者糖肽进行富集、分离，有效地降低样品的复杂程度，从而提高糖蛋白的鉴定效率。现在针对糖蛋白或者糖肽常用的富集、分离手段主要有以下三种：凝集素亲和法；酰肼、硼酸化学富集法；亲水相互作用色谱法。其中酰肼化学法由于被富集糖蛋白或者糖肽与酰肼发生共价连接，因为可以有效提高富集效率，降低非糖蛋白或者非糖肽对其检测的干扰。然而，传统的酰肼材料都是将酰肼官能团固定于特定的载体之上，例如琼脂糖、磁珠或者硅球，利用其表面的酰肼官能团实现对溶液中糖蛋白或者糖肽的富集。因此，由于反应位阻的存在，大大降低了其和糖蛋白或者糖肽中醛基反应的速率，直接降低了其对糖蛋白或者糖肽的富集效率。pH敏感聚合物由于含有弱酸性或者弱碱性单体，随着体系pH值、离子强度等因素的改变，这些离子发生电离，造成高分子内外离子浓度的改变，并导致大分子链段间氢键的解离，引起不连续的溶胀体积的变化或溶解度的改变。在低pH条件下，聚酸类pH敏感聚合物中的羧基接受质子，此时静电斥力逐渐消失，最终导致高聚链的聚结；在中性或者较高pH条件下释放质子，分子间较强的静电斥力使得聚合物呈聚电解质状态。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种提高反应速率和糖肽富集效率的酰肼化pH敏感型聚合物及其制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，所述引发剂的投料量为0.02％-2％w/v，所述有机相和水相的体积比为1:10-10:1。作为本专利技术进一步的方案：所述酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为8:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为5:1，所述引发剂的投料量为0.2％w/v，所述有机相和水相的体积比为1:1。作为本专利技术进一步的方案：所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸铵、偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的一种或两种以上。作为本专利技术进一步的方案：所述有机相为甲醇、乙腈及乙醇中的一种或两种以上。作为本专利技术进一步的方案：所述酰肼化pH敏感型聚合物在pH低于4的水相体系中沉淀析出，在pH高于4的水相体系中则完全溶解。作为本专利技术进一步的方案：所述酰肼化pH敏感型聚合物用于对糖肽进行富集，利用酰肼化pH敏感型聚合物的pH敏感性将富集得到的糖肽和非糖肽进行分离，使用肽N-糖苷酶F将所富集的糖肽释放之后，再使用质谱进行鉴定所述酰肼化pH敏感型聚合物的制备方法，具体步骤如下：(1)取料：按照使用标准称取各原料；(2)丙烯酸和丙烯酸甲酯的自由基聚合反应：将有机相和水混合得到混合溶液，并对该混合溶液中充入惰性气体除氧1.8-2.2h，将丙烯酸、丙烯酸甲酯和引发剂加入至上述除氧溶液中，继续除氧25-35min后撤去惰性气体保护，加热到55-65℃；(3)聚合物的酰肼化处理：将过夜后的反应体系放置到其温度为室温，向反应体系中加入水合肼，室温搅拌过夜，将反应体系中的有机相减压蒸馏之后将所得的酰肼化pH敏感聚合物在3K透析袋中透析2-3d，直至未反应的单体和水合肼被完全去除，最后，将其冷冻干燥得到聚合物。作为本专利技术再进一步的方案：所述惰性气体为氮气或氩气。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术是由丙烯酸和丙酸甲酯共聚之后再经过水合肼肼化获得，其中酰肼的含量明显高于商品化酰肼材料中酰肼的含量，酰肼化pH敏感聚合物中的酰肼官能团和氧化糖肽中醛基的反应为共价结合，可以提供糖肽富集的特异性，酰肼化pH敏感聚合物在pH高于4的体系中为溶解状态，可以实现其官能团酰肼和糖肽的醛基反应的均相性，从而提高反应速率及糖肽富集效率。附图说明图1为本专利技术的制备反应流程示意图。图2为本专利技术和现有商品化固相酰肼材料与糖蛋白的反应速率比较示意图。图3为未经富集的牛胎球蛋白的胰蛋白酶酶解肽段直接使用PNGaseF酶切去除糖链后的MALDI-TOF-MS质谱图。图4为牛胎球蛋白的胰蛋白酶酶解肽段经本专利技术富集后使用PNGaseF去除糖链后的MALDI-TOF-MS质谱图。图5为牛血清白蛋白和牛胎球蛋白以100:1的质量比例混合之后的胰蛋白酶酶解肽段直接使用PNGaseF酶切去除糖链后的MALDI-TOF-MS质谱图。图6为牛血清白蛋白和牛胎球蛋白以100:1的质量比例混合之后经本专利技术富集牛胎球蛋白的糖肽使用PNGaseF去除糖链后的MALDI-TOF-MS质谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。请参阅图1-6，一种酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，所述引发剂的投料量为0.02％-2％w/v，所述有机相和水相的体积比为1:10-10:1。实施例1本专利技术实施例中，一种酰肼化pH敏感型聚合物，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、过硫酸钾、水合肼、甲醇和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:2，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10，所述过硫酸钾的投料量为0.02％w/v，所述甲醇和水相的体积比为1:3。所述酰肼化pH敏感型聚合物的制备方法，具体步骤如下：(1)取料：按照使用标准称取各原料；(2)丙烯酸和丙烯酸甲酯的自由基聚合反应：将甲醇和水混合得到混合溶液，并对该混合溶液中充入氮气除氧1.8h，将丙烯酸、丙烯酸甲酯和过硫酸钾加入至上述除氧溶液中，继续除氧25min后撤去氮气保护，加热到55℃；(3)聚合物的酰肼化处理：将上述过夜后的反应体系放置到其温度为室温，向反应体系中加入水合肼，室温搅拌过夜，将反应体系中的有机相减压蒸馏之后将所得的酰肼化pH敏感聚合物在3K透析袋中透析2d，直至未反应的单体和水合肼被完全去除，最后，将其冷冻干燥得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酰肼化pH敏感型聚合物，其特征在于，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10‑10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10‑10:1，所述引发剂的投料量为0.02%‑2%w/v，所述有机相和水相的体积比为1:10‑10:1。

【技术特征摘要】
1.一种酰肼化pH敏感型聚合物，其特征在于，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为1:10-10:1，所述引发剂的投料量为0.02％-2％w/v，所述有机相和水相的体积比为1:10-10:1。2.根据权利要求1所述的酰肼化pH敏感型聚合物，其特征在于，其原料包括丙烯酸、丙烯酸甲酯、引发剂、水合肼、有机相和水，所述丙烯酸和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为8:1，所述水合肼和丙烯酸甲酯的投料摩尔比为5:1，所述引发剂的投料量为0.2％w/v，所述有机相和水相的体积比为1:1。3.根据权利要求1-2任一所述的酰肼化pH敏感型聚合物，其特征在于，所述引发剂为过硫酸钾、过硫酸铵、偶氮二异丁腈和偶氮二异庚腈中的一种或两种以上。4.根据权利要求1-2任一所述的酰肼化pH敏感型聚合物，其特征在于，所述有机相为甲醇、乙腈及乙醇中的一种或两种以上。5.根据权利要求1-2任一所述的酰肼化pH敏感型聚合物，其特征在于，所述酰肼化pH敏感型聚合物在pH低于4的水相体系中沉淀析出，在pH高于4的水相体系...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱小红，秦伟捷，白海红，张万军，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11