本发明专利技术公开了一种荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP(逆转录环介导等温扩增技术)试剂盒，包括RT-LAMP反应液、标准阳性模板、阴性质控标准品；RT-LAMP反应液包含Bst DNA聚合酶大片段、AMV逆转录酶、引物、10×ThermoPol buffer、dNTPs溶液、MgSO4溶液、钙黄绿素溶液、MnCl2溶液、甜菜碱和DEPC水。引物分为外引物、内引物和环引物。本发明专利技术具有特异性好，灵敏度高，快速简便，可重复性高以及肉眼可判断结果等优点，可对导致乙脑的乙型脑炎病毒进行快速定性检测，可替代一直沿用的传统的病毒分离鉴定和免疫学检测方法。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂 合 Sl
本专利技术涉及医疗检测
，具体的是指一种荧光可视化快速检测流行性乙型 脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒。 【
技术介绍
】 流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)是一种人畜共患病 的病原体，可引发以中枢神经系统损害为主的、通过蚊虫传播的一种急性病毒传染病，临床 症状为高热、沉郁或狂暴、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭和脑膜刺激症。乙型脑炎病毒的主要感 染对象是猪，感染乙脑病毒后，其症状主要表现为繁殖障碍：母猪表现为流产、死胎、木乃伊 胎；公猪多表现为单侧睾丸炎，精液品质不良，失去配种能力，给养猪业造成巨大的经济损 失，严重危害着养猪业的健康发展。另外，本病也多见于10岁以下的儿童，目前，我国是乙 脑发病人数最多的国家，占世界总发病数的80%以上。因此，快速检测出这种病毒是十分有 必要的。 近年发展起来的环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型的体外核酸扩增技术，因其具有简便、快速、特异性和灵 敏性高等特点，而被广泛应用于病原菌、病毒等病原体的快速分子检测，并且已经成为当前 病毒核酸定性检测的重要方法之一。环介导等温扩增技术可针对靶基因的6个区域设计4条特异引物（根据这4条 引物又可设计出2条环引物），利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA聚合酶）， 在恒温条件（65°C左右）温育约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产 物-白色焦磷酸镁沉淀以及绿色荧光。该技术具有不需要PCR仪、扩增产物不需要开盖，用 肉眼即可判断结果及反应时间短，特异性强，灵敏度高等优点。传统检测流行性流行性乙型脑炎病毒的方法，需要分离和生化鉴定，必要时还需 要血清学鉴定，一般为4~6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性、耗时费力等缺 点。各种常规PCR方法具有敏感性强、特异性高、简便、快速等优点，有较多应用于病毒检测 的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而 限制了其在基层地区及条件落后地区的应用。因此亟待开发精确、灵敏、快速、无污染的临 床检验方法。 【
技术实现思路
】有鉴于此，为克服现有技术的不足，本专利技术提供一种特异性好、灵敏度高的荧光可 视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP试剂盒。为实现上述目的，本专利技术提供的荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的 RT-LAMP试剂盒，其特征在于：包括RT-LAMP反应液，标准阳性模板和阴性质控标准品； RT-LAMP反应液含有引物，引物如下： 上游外引物 F3 :5'-ITCATAGAAGGAGCCAGTG-3' ；（SEQ ID No. 1) 下游外引物 B3 :5'-TGGGCTTCTCCAGTCGTG-3' ；（SEQ ID No. 2) 上游内引物 FIP :5'-GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGGCCACTTGGGTGGACTTG-3' ；（SEQ IDNo. 3) 下游内引物 BIP :5' -AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCCGAGCCACCGTCGAGATG-3' ；（SEQ IDNo. 4) 环引物 LF :5' -CAAGCAGCTGTCTCCTTCTAGCAC-3' ；（SEQ ID No. 5) 环引物 LB :5'-TACTGCTATCATGCTTCAGTCACT-3'。（SEQ ID No. 6) 具体如下： (1) RT-LAMP 反应液 RT-LAMP反应液是由8. OU/yL Bst DNA聚合酶大片段、lOU/yL AMV逆转录 酶、10 X ThermoPol buffer、10 ~20 y mol/L 的外引物、10 ~20 y mol/L 的内引物、10 ~ 20 y mol/L 的环引物、5. 0mol/L 甜菜喊、50mmol/L MgS04溶液、10mmol/L dNTPs 溶液、 1. 0mmol/L钙黄绿素溶液、10mmol/L MnCl2溶液和DEPC水组成。 在本专利技术的一个具体方案中，RT-LAMP反应液由lOXThermoPol buffer 2. 5 y L， 10 ~20 y mol/L 内引物 FIP、BIP 各 1. 5 y L，10 ~20 y mol/L 外引物 F3、B3 各 0? 25 y L， 10 ~20 y mol/L 环引物 LF、LB 各 0? 6 y L，lOmmol/L dNTPs 溶液 2. 0 y L，50mmol/L MgS04溶 液 3. 0 y L，5. Omol/L 甜菜碱 3. 0 y L，8. 0U/ y L BstDNA 聚合酶大片段 1. 0 y L，10U/ y LAMV 逆转录酶 1. 0 U L，1. Ommol/L 钙黄绿素溶液 0. 6 y L、lOmmol/L MnCl2溶液 1. 3 y L 和 DEPC 水 0? 9 y L组成，反应液总体积20 y L〇 (2)标准阳性模板 标准阳性模板是含有流行性乙型脑炎病毒高度保守基因E基因的230个碱基对的 核苷酸片段构成的PUC57-E230重组质粒，该重组质粒可在大肠杆菌DH5 a中增殖。 E基因的230个核苷酸序列为： 5'-CAATCGTGACTTCATAGAAGGAGCCAGTGGAGCCACTTGGGTGGACTTGGTGCTAGAAGGAGACAG CTGCTTGACAATCATGGCAAACGACAAACCAACATTGGACGTCCGCATGATTAACATCGAAGCTAGCCAACTTGCTG AGGTCAGAAGTTACTGCTATCATGCTTCAGTCACTGACATCTCGACGGTGGCTCGGTGCCCCACGACTGGAGAAGCC CACAACGAGA-3,（SEQ ID No. 7) 实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒PUC57-E230,该质粒转化大肠杆菌 DH5 a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，-20°C保存。 (3)阴性质控标准品 阴性质控标准品为无核酸酶的无菌水。 本专利技术应用RT-LAMP试剂盒检测流行性乙型脑炎病毒的方法，包括以下步骤： (1)用Trizol法从待测样品中提取RNA ; (2)将RNA加入到RT-LAMP试剂盒的反应体系中，64°C保温50min ; (3)反应结束后，肉眼观察溶液颜色的变化，对样品进行定性分析。 本专利技术的优点在于：本专利技术荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT-LAMP 试剂盒可对流行性乙型脑炎病毒进行定性检测，替代一直沿用的传统的病毒分离鉴定和免 疫学检测方法；应用本专利技术的试剂盒与传统方法相比，检测速度快，仅需50min，加上样品 RNA的提取制备，总共不超过4h ;特异性好，灵敏度高；步骤简单，可重复性高；可同时进行 多个样品检测。 【【附图说明】】 图1是本专利技术流行性乙型脑炎病毒经RT-LAMP反应后的荧光可视化结果。 图中：1、标准阳性模板，2、流行性乙型脑炎病毒阳性样本，3、流行本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光可视化快速检测流行性乙型脑炎病毒的RT‑LAMP试剂盒，其特征在于：包括RT‑LAMP反应液，标准阳性模板和阴性质控标准品；所述RT‑LAMP反应液含有引物，所述引物如下:上游外引物F3：5'‑TTCATAGAAGGAGCCAGTG‑3'；下游外引物B3：5'‑TGGGCTTCTCCAGTCGTG‑3'；上游内引物FIP：5'‑GCGGACGTCCAATGTTGGTTTGGCCACTTGGGTGGACTTG‑3'；下游内引物BIP：5'‑AAGCTAGCCAACTTGCTGAGGTCCGAGCCACCGTCGAGATG‑3'；环引物LF：5'‑CAAGCAGCTGTCTCCTTCTAGCAC‑3'；环引物LB：5'‑TACTGCTATCATGCTTCAGTCACT‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，杨梦歌，覃玥，
申请(专利权)人：武汉真福医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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