本发明专利技术公开了一种捕获内皮祖细胞EPCs的新型抗凝血支架涂层的制备方法，其主要步骤是先对材料表面进行羟基化处理，然后在Tris-base(pH8.5,2mg/ml)溶液中溶解多巴胺，然后在材料表面37℃沉积一层或者多层多巴胺膜，然后根据pH和EDC/NHS浓度调节反应条件，最后在37℃条件下共价接枝CD133+(0.8～3.2ug/ml)和Fucoidan(50-400ug/ml)的混合生物获得目标产物。本发明专利技术具有操作简单，反应条件温和，效率高，成本低优点。其目标物涂层由于低分子量岩藻聚糖的作用，具有较强的抗血栓，抗凝血和抑制平滑肌内膜增生的作用，能够快速地捕获外周血的内皮祖细胞，从而诱导其分化成内皮细胞，形成完整的内皮细胞层，具有优异抗凝血性能和生物相容性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学工程材料，尤其是获得具有良好血液相容性的捕获干细胞及内皮祖细胞EPCs的多功能涂层。
技术介绍
据世卫组织报到，心血管疾病已成为人们死亡的主要杀手，PCI支架介入手术治疗是较为成熟有效的方法，能够极大的减轻人们的痛苦和降低死亡率。然而，在介入手术治疗后，再狭窄和晚期血栓在支架介入后3-6个月仍然有高达30 %的比率发生，这主要由于支架表面生物相容性和功能性的不足，不能够快速的形成完整连续的内皮层所致。血管内层主要由单层的内皮细胞和基膜构成，中层主要有平滑肌细胞构成，新生内膜的形成主要通过内皮细胞的迀移、增殖，以及EPCs内皮祖细胞的动员、归巢和分化共同作用，内膜增生的主要原因是由于SMCs平滑肌细胞的快速增生所导致的，因此如何快速内皮化成为发展新的血管介入器械的研宄热点和主要策略。EPCs是内皮细胞ECs的前体细胞，能够通过一定的信号路径和信号因子分化成内皮细胞，在人体组织受到损伤时，来自于骨髓中的外周血EPCs细胞被大量动员起来参与缺血组织的修复。晚期血栓的发生主要取决于材料和血液接触的界面的相互排斥所产生的，因此可以通过构建具有多功能的生物分子涂层在能够促进血管表面的快速内皮化的同时提高材料的生物相容性，避免内膜增生和晚期血栓发生，这是一种十分完美的设想。当前流行的策略是构建能够仿生细胞外基质膜的组成和构建促进内皮细胞生长的友好微环境，亦或诱导归巢内皮细胞生长的生物工程涂层等，例如构建肝素h印arin，REDV多肽，VEGF生长因子的混合涂层，当然，最具有创新性的策略是通过捕获外周血中EPCs，从而最大化的促进血管的快速内皮化。应用CD34+抗体涂层的血管支架的显著降低了再狭窄和晚期血栓的发生，但是CD34+不是EPCs的特异性标记物，还能够分化成其它的细胞，从而导致再狭窄的产生，因此循环血液中的其它细胞也能管被CD34+抗体捕获，如红细胞和成纤维细胞被捕获等。⑶133+作为造血干细胞和EPCs的特异性标记物，属于⑶34+抗体家族一员，⑶133+抗体能够有效捕获外周血中的EPCs祖细胞和造血干细胞，研宄表明CD133+细胞能够有效提高损伤组织功能的恢复，同时动员EPCs细胞参与血管修复。然而，在大多数情况下，往往促进内皮化的同时，植入材料表面的抗凝血性能和血液相容性较差，例如胞外基质蛋白，CD133等，因此我们还需要共接枝一种具有优秀生物相容性的生物分子。低分子量岩藻聚糖Fucoidan(来自于fucus vesiculosus)是一种褐藻中提取的水溶性的硫酸盐多糖，相关研宄表明低分子量岩藻聚糖LMWF (分子量小于10000)具有抑制平滑肌的生长从而达到控制内膜增生的目的，同时由于较高的硫酸盐含量，有着优良的抗凝血作用，能够通过束缚纤维胶原抑制抗凝血达到提高生物相容性的目的。尤为重要的是岩藻聚糖Fucoidan还可以促进内皮祖细胞EPCs增殖和动员EPCs迀移参与血管修复成管的能力，因此低分子量岩藻聚糖LMWF作为一种理想的生物分子共同构建捕获和趋化EPCs的良好的生物相容性的多功能涂层。多巴胺做为一种理想的生物仿生涂层基底，它具有极好的粘附性能在各种材料表面吸附，并且潜在做为反应平台固定各种蛋白，以及其优良的血液相容性。EDC/NHS/MES做为反应共价偶联剂，能够催化加速共价固定生物的涂层固定，相较其他物理化学的方法，相对稳定可靠和可重复性，随后我们通过QCM-D筛选出最优的pH和EDC/NHS/MES浓度作为构建⑶133和Fucoidan的多功能复合涂层的反应条件。
技术实现思路
鉴于现有技术的以上缺点，本专利技术的目的是获得一种用于捕获内皮祖细胞的血管支架的抗凝血材料表面涂层的制备技术。目标物涂层的制备具有更好的材料涂层的生物相容性和血液相容性。并使其具有具备操作简单，成本相对低廉的优点。本专利技术为解决其技术问题，所采用的步骤如下:，由如下步骤获得:a)将需要的基底支架依次用SDS,乙醇，去离子水超声清洗三次，每次lOmin，然后干燥处理；b)基底支架羟基化处理:将a)处理完成的基底支架放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比配制的溶液中在100°C浸泡2h ;然后用去离子水清洗3次，每次5min ;c)将b)步所得羟基化基底支架放到Tris-base (1mM, pH8.5)缓冲溶液中，浸泡8h,然后用离子水超声清洗3次，每次5min，然后继续浸泡，连续3次，获得表面沉积多巴胺薄膜的基底支架，密封保存；d)将配好的CD133溶液和Fucoidan各50ul滴加到玻片表面；在37°C的孵箱中反应4h，然后用RO水清洗3次，然后用N2干燥，得到目标产物。采用本专利技术方法制备的⑶133/Fucoidan心血管支架多功能涂层，能够捕获外周血的干细胞及前期EPCs细胞，并且具有优异的抗凝血能力，显著降低血小板的激活程度，因此能够达到促进材料表面快速内皮化和成管的能力，并且能够降低晚期血栓，避免突发性死亡事件的发生。与现有技术相比，本专利技术的优点如下:1、传统的快速内皮化的方法，是在材料表面构建基于血管微环境的仿生涂层，在促进ECs细胞生长的同时，抑制平滑肌的增生，但是该种方法快速内皮化效率较低，不能够提高和调动EPCs内皮祖细胞参与血管修复，EPCs在新血管的形成中发挥着巨大的作用，能够保护缺血的器官组织，分化为ECs内皮细胞，从而加速加速内皮化，避免再狭窄。2、本专利技术的⑶133/Fucoidan捕获涂层可以高效的捕获外周血中来自骨髓的⑶133，从而加速血管修复。3、现有的CD34+捕获支架在商业应用中获得很大的成功，但是存在着许多的不足，它不是EPCs细胞的特异性标记物，有着很大的局限性，某些情况下还可能使再狭窄恶化。CD133作为造血干细胞和内皮祖细胞的一部分，具有很大的特异性和针对性，甚至还有EPCs的某些共同特性，能够调动血液中的ECs迀移和EPCs的分化，从而参与血管的分化和功能的修复。4、已有的⑶133支架只针对了造血干细胞的研宄，并且没有基于对材料涂层的抗凝血的提高，对于后期的晚期血栓和炎性反应没有考虑进去，因此有一定的局限性。因此本专利技术具有很强的应用潜力。采用本方法制备的涂层，多巴胺dopamine具有的很强的生物相容性，并且具有粘附性能，能够吸附在多种材料表面，如惰性材料陶瓷，合金材料镍钛合金NiTI和NiCr，金属不锈钢和氧化钛等，同时具有优异的官能团，能够固定那些含有巯基，羧基和氨基的生物分子。并且采取EDC/NHS偶联剂作为共价级联反应，能够加快和稳定接枝的蛋白抗体。本专利技术制备的涂层均匀厚度小于50nm，原料投入较小，并且还可以在材料表面进行各生物分子含量的调控，因此本专利技术简便，适用性较强，成本低廉可靠。本专利技术采用的低分子量岩藻聚糖Fucoidan，具有优异的抗凝血性能，并且抑制炎性反应，平滑肌SMCs的生长和降低蛋白水解，可用于炎性患者的治疗，还有一些研宄表明LMWF通过FGF-2和VEGF调控EPCs参与血管的修复，因此与⑶133有一些叠加作用。是一种优于肝素的抗凝血的生物分子。【附图说明】图la):QCM中的Af图；b):不同反应条件的Af值变化图。由于Af的变化同吸附量的变化成正比图2不同表面改性后样品的全谱和C元素的高分辨谱，(G，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种捕获内皮祖细胞EPCs的新型抗凝血支架涂层的制备方法，由如下步骤获得：a)将需要的基底钛(Ti)合金支架依次用SDS，乙醇，去离子水超声清洗三次，每次10min，然后在烘箱中干燥；b)基底Ti合金支架羟基化处理：将a)处理完成的基底Ti支架放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比配制的溶液中在100℃浸泡1h，激活支架表面的羟基；然后用去离子水(RO水)清洗3次，每次5min；c)将b)步所得羟基化基底支架放到多巴胺Dopamine(dopamin溶解到Tris‑base(10mM,pH8.5)溶液中,每次浸泡8h，每次浸泡完后用去离子水超声清洗3次，每次5min，连续3次，获得表面沉积多巴胺薄膜的基底支架，密封保存；d)将配好一定浓度的CD133溶液和Fucoidan溶液各50ul滴加到支架基底材料表面；在37℃的孵箱中反应4h，然后用RO水，轻轻地清洗3次，然后用N2干燥，得到目标产物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵安莎，薛国能，黄楠，杨苹，王艳，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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