一种检测癌症相关DNA甲基化的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种检测癌症相关DNA甲基化的试剂盒及应用。本发明专利技术提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为癌症样本产品中的应用。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术的方法及引物对可以鉴定待测样本是否为癌症样本或鉴定待测患者是否为癌症患者，可及时准确鉴定单个样本，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好，而且用阈值代替统计和累积分析，更有可能用于癌症的即时诊断。

【技术实现步骤摘要】
一种检测癌症相关DNA甲基化的试剂盒及应用
本专利技术涉及生物
中一种检测癌症相关DNA甲基化的试剂盒及应用。
技术介绍
DNA甲基化是一项重要的表观遗传学机制，在人类癌症发生发展中发挥着重要的作用。特定基因的启动子区甲基化异常引起了人们的广泛关注，被认为是癌症诊断的潜在标志物。在癌症中只有极少数的单独基因被证明是甲基化比例很高的。因此，检测一组基因的甲基化状态，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。至今人们已研究了多种癌症的甲基化谱。对于一个理想的甲基化谱而言，准确的检测方法和逻辑的数据分析都是必不可少的。2012年，已经建立了一种统计多个基因的甲基化水平的方法，根据候选基因的甲基化水平进行癌症样本和正常样本的逐步累积分析。与以前的统计方法相比，这个方法充分考虑了不同基因的甲基化程度和影响，然而，这个方法需要对大量样本进行统计分析，因此很难应用于即时单个样本或少量样本的诊断。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质的用途。本专利技术提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本产品中的应用。本专利技术的另一个目的是提供检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质的用途。本专利技术提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品中的应用。上述应用中，所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值为所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值之和。所述赋值标准如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值小于0.3，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为1；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于等于0.3且小于等于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为2；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为3。本专利技术第三个目的是提供检测待测样本基因组中RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质的用途。本专利技术提供了检测待测样本基因组中RASSF1A基因启动子区CCGG位点甲基化水平、OPCML基因启动子区CCGG位点甲基化水平和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本产品中的应用。本专利技术第四个目的是提供检测待测患者基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质的用途。本专利技术提供了检测待测患者基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因的启动子区CCGG位点甲基化水平的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品中的应用。上述应用中，所述待测样本为单个样本。上述应用中，所述产品为试剂盒。本专利技术的第五个目的是提供上述物质。本专利技术提供的上述物质，为如下1)或2)：1)鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本的产品；2)鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品。上述物质包括扩增RASSF1A基因启动子区CCGG位点的引物对、扩增OPCML基因启动子区CCGG位点的引物对和扩增HOXA9基因启动子区CCGG位点的引物对。上述物质中，所述扩增RASSF1A基因启动子区CCGG位点的引物对由序列表中序列1所示的单链DNA分子和序列表中序列2所示的单链DNA分子组成；所述用于扩增OPCML基因启动子区CCGG位点的引物对由序列表中序列3所示的单链DNA分子和序列表中序列4所示的单链DNA分子组成；所述用于扩增HOXA9基因启动子区CCGG位点的引物对由序列表中序列5所示的单链DNA分子和序列表中序列6所示的单链DNA分子组成。所述物质还包括记载在可读载体上的赋值标准和判断标准：所述赋值标准如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值小于0.3，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为1；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于等于0.3且小于等于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为2；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为3。所述判断标准如下:(1)若SUM大于4，则待测样本为或候选为卵巢癌样本；待测患者为或候选为卵巢癌患者；(2)若SUM小于等于4，则待测样本为或候选为非卵巢癌样本；待测患者为或候选为非卵巢癌患者。HpaII酶是一种甲基化敏感限制性内切酶，能特异性地切断非甲基化的5′-CCGG-3′序列，而不影响甲基化的5′-CCGG-3′序列。提取的基因组DNA被分为两部分：A部分进行HpaII处理，非甲基化的DNA被切断，只保留甲基化的DNA；B部分不进行HpaII处理，甲基化和非甲基化的DNA都保持完整。在进行PCR扩增时，A部分只有甲基化的DNA被扩增，B部分非甲基化和甲基化的DNA都被扩增。所用的引物的设计原则为：设计的扩增区域应含有2或3个5′-CCGG-3′位点，而且不能占据引物位置。PCR引物用DNAMAN软件设计，通过调整引物长度，使溶解温度Tm值接近或高于60℃。荧光标记采用PCR扩增，扩增中的dNTP为荧光素标记的dATP或dGTP或dCTP或dUTP。本专利技术的实验证明，本专利技术的方法及引物对可以鉴定待测样本是否为癌症样本或鉴定待测患者是否为癌症患者，通过甲基化水平的联合分析，设定了癌症诊断的阈值，待测样本的SUM值超过阈值即为癌症样本，这一诊断结论是确定的。本专利技术可及时准确鉴定单个样本，与检测单独基因的甲基化状态相比，诊断灵敏度更高、特异性更好。而且用阈值代替统计和累积分析，更有可能用于癌症的即时诊断。以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。附图说明图1为低甲基化水平样品的荧光光谱。图2为中甲基化水平样品的荧光光谱。图3为高甲基化水平样品的荧光光谱。图4为35个癌症样本和11个正常样本的RASSF1A基因的甲基化水平分布。图5为35个癌症样本和11个正常样本的OPCML基因的甲基化水平分布。图6为35个癌症样本和11个正常样本的HOXA9基因的甲基化水平分布。具体实施方式下本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本产品中的应用。

【技术特征摘要】
1.检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测样本是否为卵巢癌样本产品中的应用；所述物质为PFPN；所述PFPN的化学结构式如式I所示：所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值为所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值之和；所述赋值标准如下：若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值小于0.3，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为1；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于等于0.3且小于等于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为2；若RASSF1A基因、OPCML基因或HOXA9基因启动子区CCGG位点甲基化水平值大于0.7，则对应基因启动子区CCGG位点甲基化水平值赋值为3。2.检测待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的各自启动子区CCGG位点甲基化水平SUM值的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测患者是否为卵巢癌患者产品中的应用；所述物质为PFPN；所述PFPN的化学结构式如式I所示：所述待测样本基因组中RASSF1A基因、OPCML基因和HOXA9基因这三种基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王树，张江艳，刘礼兵，吕凤婷，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11