本发明专利技术公开了一种高产异淀粉酶的基因工程菌及其发酵工艺，属于基因工程和发酵工程技术领域。本发明专利技术以E.coli MDS42为宿主，构建了高产异淀粉酶的基因工程菌E.coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)。该菌株产酶水平高，生产成本较低。以该菌株为生产菌株在发酵罐进行发酵产酶，酶活力可达16434U/mL，蛋白表达量可达13.4g/L。本发明专利技术降低了异淀粉酶生产成本，可实现异淀粉酶的工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高产异淀粉酶的基因工程菌及其发酵工艺，属于基因工程和发酵 工程
技术介绍
异淀粉酶（EC 3.2. 1.68)是淀粉脱支酶的一种，它可以水解糖原、支链淀粉和 0-极限糊精中a_l，6-糖苷键，对a-极限糊精具有部分水解作用，但不能水解普鲁兰多 糖。异淀粉酶在淀粉加工工业中具有重要的应用价值，可以与糖化酶、淀粉酶、CGT酶、 4_ a -葡聚糖转移酶等淀粉酶复配生产葡萄糖、麦芽糖、环糊精、抗性淀粉等产品，缩短反应 时间，提高淀粉的转化率，降低其它糖化用酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备 利用率、降低生产成本的目的。尽管异淀粉酶在工业上的应用范围越来越广，但是，迄今为 止这仍然只有来源于假单胞菌Pseudomonas amyloderamosa的异淀粉酶实现了工业化生 产。 我国关于异淀粉酶的研宄起步于20世纪90年代，开展工作不多。目前为止，发 表的文献只有10余篇，主要集中于菌株筛选、诱变改良、酶分离纯化以及酶学定性。其中， 王武等首先在1993年筛选到1株产异淀粉酶的短杆菌BI25164,经过发酵优化胞外酶活力 达到520U/mL，该酶最适温度为50°C，最适pH5. 0。此后10年左右鲜有异淀粉酶的文献报 道，直到2003年以后，国内学者又分别筛选到产异淀粉酶的Bacillus、Thermus等微生物， 并开展了菌株的诱变改良和发酵优化等工作。之前本研宄室段绪果以T. fusca基因组DNA 为模板，通过PCR克隆得到了异淀粉酶编码基因，构建得到了产重组异淀粉酶的大肠杆菌， 并优化了重组异淀粉酶摇瓶发酵产酶条件，重组菌摇瓶发酵36h后胞内酶活力水平达到 879. 2U/mL ;2013年江南大学李由然筛选到1株产异淀粉酶的细菌，并对Bacillus lentus CICM304异淀粉酶基因进行了克隆、鉴定和大肠杆菌中的功能性表达，重组菌细胞破碎液 上清中酶活力为17. 6±0. 5U/mL，该酶最适温度为70°C，最适pH6. 0 ;同时，李由然将来源于 Bacillus lentus JNU3的异淀粉酶基因进行了克隆，在Pichia pastoris中实现了重组表 达，并在10L发酵罐中进行了放大实验，分批发酵条件下，72h后酶活力最高达到318U/mL。 虽然国内在异淀粉酶研宄上虽然取得了一定的进展，但是还未实现工业化生产，市场上的 商业化产品主要为进口酶制剂。 大肠杆菌菌株生长快、蛋白表达量高，是重组蛋白表达最常用的宿主。然而在之前 的报道中，异淀粉酶在大肠杆菌中的产量依然较低，且大多为包涵体。虽然E. coli MDS42也 曾被用来作为宿主菌，但是已有研宄用E. coli MDS42来生产氯霉素乙酰转移酶，发现其表 达量相比母本菌株E. coli MG1655并未提高，说明E. coli MDS42重组菌表达外源蛋白时， 可能会对菌株生长或异源蛋白的表达分泌存在某些不确定的影响。 本专利技术首次把E. coli MDS42作为异淀粉酶的表达宿主，构建了一株高产异淀粉酶 的基因工程菌，其摇瓶发酵产量可达1566U/mL，发酵罐发酵最高酶活力可达16434U/mL，降 低了异淀粉酶生产成本，实现其工业化生产。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种高产异淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程 菌是以E.coli MDS42(Scarab Genomics公司，美国）为宿主，表达来源于嗜热裂孢菌 Thermobifida fusca 的异淀粉酶。 所述异淀粉酶的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。 所述基因工程菌是以pSX2 (Scarab Genomics公司，美国）为载体构建得到的。 本专利技术的第二个目的是提供一种所述的基因工程菌的构建方法是：将核苷酸序列 为SEQIDNO.2的异淀粉酶基因连接到表达载体pSX2上，然后在转化到大肠杆菌E.coli MDS42中，筛选正确的转化子，即得到基因工程菌E. coli MDS42(Tfu_1891/pSX2)。 本专利技术的第三个目的是提供一种所述基因工程菌发酵生产异淀粉酶的方法，所述 方法是在发酵罐中，采用一次诱导或者多次诱导的策略发酵生产异淀粉酶。 所述一次诱导策略，在本专利技术的一种实施方式中，包括：⑴分批发酵阶段：将 种子液以7-9 %接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38 °C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2， 当细胞浓度达到1. 7g/L-4g/L时加入IPTG诱导产酶；（2)补料发酵阶段：待溶氧上升至 80-100%，进行补料培养，控制温度36-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,诱导19-27h。 所述一次诱导策略，在本专利技术的另一种实施方式中，包括：（1)分批发酵阶段：将 种子液以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2;(2) 补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100 %，进行补料培养，控制温度30-38°C、溶氧20-30 %、 pH 6. 8-7. 2 ; (3)诱导培养阶段：当菌体细胞浓度达到20-35g/L时，加入IPTG诱导产酶，控 制温度 30-38°C、溶氧 20-30%、pH 6. 8-7. 2,诱导 8-23h。 所述方法是采用二次诱导策略，在本专利技术的一种实施方式中，包括：（1)分批发 酵阶段：将种子液以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2 ; (2)补料发酵阶段：待溶氧上升至80-100%，进行补料培养，控制温度30-38°C、溶 氧20-30%4116.8-7.2;(3)诱导培养阶段 ：当菌体细胞浓度达到20-35§/1、57-83§/1，分 别加入IPTG诱导产酶，控制温度30-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,诱导8-23h。 所述方法是采用三次诱导策略，在本专利技术的一种实施方式中，包括：（1)将种子液 以7-9%接种量接种于发酵罐中，控制温度35-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,当菌体细 胞浓度达到1. 7g/L-4g/L时加入IPTG诱导产酶一次；（2)待溶氧上升至80-100 %，进行补 料培养，控制温度30-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2 ;(3)当菌体细胞浓度达到20-35g/L、 57-83g/L，分别加入IPTG诱导产酶，控制温度36-38°C、溶氧20-30%、pH 6. 8-7. 2,从第二 次加入诱导剂开始算起，诱导8-20h。 所述发酵方法中的诱导，在本专利技术的一种实施方式中，诱导温度为36-38°C。 所述发酵方法中的诱导，在本专利技术的一种实施方式中，诱导剂IPTG的终浓度为 0. 01-0. 05mM。 所述发酵方法中的诱导，在本专利技术的一种实施方式中，诱导剂IPTG的终浓度 0. 05mlL 所述补料培养，在本专利技术的一种实施方式中，是采用指数流加的方式流加补料培 养基。 所述方法，在本专利技术的一种实施方式中，具体是：（1)将种子液以8%接种量接入 发酵培养基，控制溶氧30%、温度37°C、pH 7. 0 ; (2)待溶氧上升至80-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产异淀粉酶的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以E.coli MDS42为宿主，表达来源于嗜热裂孢菌Thermobifidafusca的异淀粉酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，段绪果，冉红艳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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