本发明专利技术公开了一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法：本方法首先从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得cDNA片段，并以此为模版克隆获得山羊的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制细胞培养液。利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细胞集落判定为山羊iPS细胞集落。采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。
【技术实现步骤摘要】
： 本专利技术涉及干细胞工程、珍稀物种的保存和组织与细胞工程等领域。 技术背景： 山羊iPS细胞的产生过程中多能性转录因子的导入都需要合适的运载系统，而利 用运载系统导入方式的高效性和安全性是iPS细胞制备技术的研宄重点。现在运载系统 的研宄方法主要分为四类：基因插入不可删除型，包括逆转录病毒、组成型和诱导型慢病毒 等。该方法是利用连接有多能性转录因子0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc或Nanog、Lin28的病毒 性载体感染293或293T细胞制备病毒质滴，后感染目的细胞制备iPS细胞。该载体在目 的细胞中不可删除，可在目的细胞中随机整合；基因插入可删除型，包括转座子运载系统和 cre-Lox改造的慢病毒。以piggyBac转座子运载系统为例，该方法利用携带0ct4、Sox2、 Klf4和c-Myc多能性转录因子的piggyBac转座载体，经转染试剂介导转染目的细胞以获得 iPS细胞。该方法的运载系统可在目的细胞中自行删除，易导致插入突变；无基因插入型， 包括质粒瞬时转染、腺病毒、RNA-仙台病毒等。以质粒瞬时转染为例，该方法利用体外构建 的真核表达载体通过携带0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28等多能性转录因子直接 转染目的细胞，通过多次反复转染以期获得iPS细胞。该方法制备周期长，操作繁琐，制备 效率低；无核酸参与型，包括转录因子的蛋白质转染、小分子化合物诱导、microRNA和mRNA 转染等。该方法的主要步骤是利用体外转录或体外翻译获得的0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc、 Nanog、Lin28等多能性转录因子的mRNA或蛋白质直接转染目的细胞，通过反复多次转染获 得iPS细胞。该方法无DNA参与，安全性好、诱导效率高。目前，急需一种安全、便捷、高效的 iPS细胞制备方法，来满足山羊iPS细胞试验的需要，从而加速山羊iPS细胞的研宄进展。
技术实现思路
： 针对目前山羊iPS细胞制备周期长、效率低且操作繁琐、安全性低等问题，本专利技术 采用0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的mRNA转染目的细胞的方法，具有制备周 期短、安全性及制备效率高等优势。采用本方法，转染后第18天左右可获得山羊iPS细胞， 诱导效率为1. 15%左右，与传统方法比较发现，以目前常用的慢病毒载体制备山羊iPS细 胞为例，制备周期缩短1-2天，制备效率提高两倍，并且获得的山羊iPS细胞的形态更加的 与山羊胚胎干细胞类似。专利技术提出的快速安全制备山羊iPS细胞的方法具有巨大的应用前 景，为山羊iPS细胞的研宄提供了重要的技术保障。 本专利技术目的在于为人们提供一种新的制备山羊iPS细胞的方法。 本专利技术包括以下步骤： 1.从山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织中提取总RNA，反转录获得CDNA片段，并 以此为模版克隆获得山羊的0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编码序列。 2?构建pcDNA3. 0_oct4、pcDNA3. 0_sox2、pcDNA3. 0_klf4 和pcDNA3.O-c-myc真核 表达载体，利用相应的限制性内切酶进行线性化处理。随后利用体外转录试剂盒进行体外 转录。对该转录产物利用RNA纯化试剂盒进行纯化，以备后续转染用。 3.利用胰酶消化法获得山羊及小鼠的胎儿成纤维细胞，并制备饲养层细胞和配制 细胞培养液。 4.利用体外转录试验获得的各多能性转录因子的mRNA，经脂质体2000介导，转染 山羊胎儿成纤维细胞，以制备山羊iPS细胞。 5.在显微镜下将视野内克隆扁平、致密、核质比大、克隆边界清晰和折光性强的细 胞集落判定为山羊iPS细胞集落。 6.采用单克隆挑取，分别用胰酶消化，单独接种至新的接种有饲养层的培养孔板 中继续培养，以获得山羊iPS细胞系。 本专利技术的优越性在于： 1.制备周期短，制备效率及安全性高； 2.方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行； 3.采用本方法，转染后第18天左右可获得山羊iPS细胞，诱导效率为1. 15%左 右，与传统方法比较发现，以目前常用的慢病毒载体制备山羊iPS细胞为例，制备周期缩短 1-2天，制备效率提高两倍，并且获得的山羊iPS细胞的形态更加的与山羊胚胎干细胞类 似。; 4.为偶蹄类动物iPS细胞的制备提供了新的方法，同时也为今后山羊iPS细胞后 续研宄提供了方法和途径； 5.该技术也适用于其它物种iPS细胞的制备，可用于珍贵物种的利用与开发。【具体实施方式】 -、多能性转录因子的克隆 ①总RNA提取 利用RNA提取试剂盒分别提取山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织的总RNA，提取 步骤为： (1)在用DEPC水处理过的研钵中分别加入50-100mg山羊睾丸组织、皮肤组织和 小肠组织样品，加入液氮迅速研磨至粉状，分别装入1. 5mL EP管中，并分别快速加入lmL的 Trizol，混匀后室温静止10分钟； (2)用标准为4°C、12000rpm的冰冻离心机离心10min，移上清至新的EP管中，加 200 y L氯仿用力反复摇晃15s，25°C下放置3min后用同样标准离心15min; (3)将EP管中上面的水相移到另外一个新管中，加400 yL异丙醇，混匀，室温放置 15min，然后以相同标准离心10min; (4)弃上清液，加lmL用DEPC水处理的75%乙醇洗涤RNA，然后以相同标准离心 5min； (5)弃去乙醇，在空气中干燥5min，加入20 yL的去离子甲酰胺，轻轻吹吸几次，将 RNA完全溶解，并分装后-80°C保存；② RT-PCR 反应 将上述总RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA片段，并以此为模版，利用高保 真primer star mix酶、上下游引物，克隆0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc多能性转录因子的编 码序列，其中，扩增体系为：模板lul，上下游引物各lul，酶12. 5ul，d2H20 9. 5ul ;反应条件： 94°C预变性2min，94°C变性lmin，退火30sec (其中0ct4退火温度为56°C、Sox2退火温度 为56°C、Klf4退火温度为58°C、c-Myc退火温度为60°C )，72°C延伸30sec，重复35个循环， 72°C 延伸 10min，4°C 保存； ③克隆产物与T载体连接 扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段后与PMD19-T simple 克隆载体连接：条件为16°C，16h ; ④感受态细胞的制备及转化 (1)感受态细胞制备：挑取在LB固体培养基上生长的受体菌单菌落，按照1:100 的比例接种于LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，取250uL培养过夜受体菌接种于25mL LB液体培养基中剧烈振摇培养至0D600值0. 5左右，将菌液转入50mL离心管中，冰上放置 lOmin，在4°C，5000rpm离心10min，弃去上清，将管倒置一边液体流尽；用冰预冷的0. lmol/ LCaC1210mL重悬沉淀，冰上放置30min ;4°C，5000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL冰预 冷的0. lmol/LCaC12和80%甘油混合液重悬，并冰上放置。分装后-70°C保存本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种获得山羊诱导性多能干细胞的新方法，其特征在于：包括如下步骤：一、多能性转录因子的克隆①总RNA提取利用RNA提取试剂盒分别提取山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织的总RNA，提取步骤为：(1)在用DEPC水处理过的研钵中分别加入50‑100mg山羊睾丸组织、皮肤组织和小肠组织样品，加入液氮迅速研磨至粉状，分别装入1.5mL EP管中，并分别快速加入1mL的Trizol，混匀后室温静止10分钟；(2)用标准为4℃、12000rpm的冰冻离心机离心10min，移上清至新的EP管中，加200μL氯仿用力反复摇晃15s，25℃下放置3min后用同样标准离心15min；(3)将EP管中上面的水相移到另外一个新管中，加400μL异丙醇，混匀，室温放置15min，然后以相同标准离心10min；(4)弃上清液，加1mL用DEPC水处理的75％乙醇洗涤RNA，然后以相同标准离心5min；(5)弃去乙醇，在空气中干燥5min，加入20μL的去离子甲酰胺，轻轻吹吸几次，将RNA完全溶解，并分装后‑80℃保存；②RT‑PCR反应将上述总RNA利用反转录试剂盒反转录获得cDNA片段，并以此为模版，利用高保真primer star mix酶、上下游引物，克隆Oct4、Sox2、Klf4和c‑Myc多能性转录因子的编码序列，其中，扩增体系为：模板1ul，上下游引物各1ul，酶12.5ul，d2H2O 9.5ul；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性1min，退火30sec,其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c‑Myc退火温度为60℃，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；③克隆产物与T载体连接扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段后与pMD19‑T simple克隆载体连接：条件为16℃，16h；④感受态细胞的制备及转化(1)感受态细胞制备：挑取在LB固体培养基上生长的受体菌单菌落，按照1:100的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，取250uL培养过夜受体菌接种于25mL LB液体培养基中剧烈振摇培养至OD600值0.5左右，将菌液转入50mL离心管中，冰上放置10min，在4℃，5000rpm离心10min，弃去上清，将管倒置一边液体流尽；用冰预冷的0.1mol/LCaCl2 10mL重悬沉淀，冰上放置30min；4℃，5000rpm，离心10min，弃去上清，加入2mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2和80％甘油混合液重悬，并冰上放置。分装后‑70℃保存备用；(2)转化：取制备好的感受态细胞DH5α，迅速放于冰上融化，将10μL连接反应产物加入200μL的感受态细胞中，轻轻旋转以混匀，冰中放置45min；42℃热激45‑90s，快速将离心管转移到冰浴中，细胞冷却2‑3min；每管加入800μL LB液体培养基，于37℃轻微振荡培养1h；超净台中将200μL菌液涂布到含有氨苄青霉素的LB平板上，均匀涂板，37℃恒温培养12‑16h；⑤菌液PCR、单双酶切、测序鉴定挑取平板上的阳性菌落，将单菌落接种到含氨苄青霉素的1ml LB培养基中，180rpm摇床培养4‑6h，吸取菌液进行PCR检测，反应体系如下：菌液模板1μL,rTaq酶0.5μL,dNTP 2μL,10×buffer 2μL,Primer F 1μL,Primer R 1μL,d2H2O 12.5μL,总体积20μL；反应条件：94℃预变性2min；94℃变性1min，退火30sec(其中Oct4退火温度为56℃、Sox2退火温度为56℃、Klf4退火温度为58℃、c‑Myc退火温度为60℃)，72℃延伸30sec，重复35个循环，72℃延伸10min，4℃保存，扩增产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测；将菌液PCR鉴定正确的条带，根据转录因子各自引入的酶切位点，分别采用EcoR I、XhoI、XbaI进行单酶切与双酶切，将酶切鉴定正确的进行测序，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19‑T‑Oct4、pMD19‑T‑Sox2、pMD19‑T‑Klf4和pMD19‑T‑c‑Myc；二、真核表达载体的构建用EcoRI和XhoI限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19‑T‑Oct4、pMD19‑T‑Sox2、pMD19‑T‑c‑Myc质粒，用EcoRI和Hind III限制性内切酶双切鉴定正确的pMD19‑T‑Klf4质粒，胶回收目的片段，同时用相对应的限制性内切酶双切pcDNA3.0载体，胶回收目的载体，用T4 DNA连接酶16℃条件下连接16h，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、单双酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pcDNA3.0‑Oct...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，张亚妮，邱峰龙，左其生，李东，张蕾，连超，汤贝贝，王颖洁，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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