本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及可删除筛选标记基因的植物表达载体及其用途。本发明专利技术要解决的技术问题是获得无选择标记转基因柑橘的周期长、工作量大。本发明专利技术提供了可删除筛选标记基因的植物表达载体，该载体包括目标基因表达元件和Cre/Loxp系统；所述Cre/Loxp系统为在2个loxP位点间构建ipt基因表达原件和Cre重组酶表达原件。本发明专利技术还提供了快速获得无选择标记转基因柑橘的方法，包括遗传转化和嫁接2个步骤。本发明专利技术植物表达载体可用于转基因植物的获得，并能快速有效的删除筛选标记基因。本发明专利技术方法可用于多年生木本植物，快速获得无筛选标记的转基因植株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及可删除筛选标记基因的植物表达载体及 其用途。
技术介绍
目前柑橘遗传转化通常用的载体一般含有筛选标记基因，如报告基因gus，抗 Kan，抗除草剂Bar等筛选标记基因，这些基因对生物安全性构成严重威胁。其存在的不足 是：再生率低，再生时间长，不定芽成活率低，加有报告基因，进入田间抗性分析时间长等。 如Kan作为柑橘遗传转化中常用的筛选标记基因，但由于再生芽上残存的农杆菌与邻近的 阳性转化细胞提供的抗性。Kan并不能完全抑制非阳性芽的生长，尤其是多年生木本植物 Kan筛选率更低，如通过根癌农杆菌介导CrylAc基因转化'雪青'梨，从转化抗性再生芽中 仅获得约10%的PCR阳性芽；双如冰糖橙转化后获得Kan抗性芽有105个，经GUS染色，阳 性芽为24个，进一步PCR检测仅得到15株阳性芽，约14% PCR阳性芽；纽荷尔脐橙外植体 转化后获得Kan抗性芽13个，PCR检测抗性芽仅2株为阳性；红江橙转化后获得12株Kan 抗性芽，经⑶S染色，阳性芽仅2株；且最终都要通过对大量转化再生芽进行PCR检测，才能 初步获得转基因阳性植株。 目前，即无Kan筛选基因，也无报告基因如⑶S等新型转基因载体以获得无选择 标记基因转基因材料成为基因工程育种的趋势，因此，利用这类植物表达载体进行柑橘遗 传转化，如在Cre/Loxp系统删除作用下不仅获得目的功能基因的转基因植株，还避开抗生 素、抗除草剂等标记基因对生物学安全性影响的风险，为转基因血橙将来进行安全性评价 提供分子证据，使之快速进入生产应用提供有利保障。 目前，通过转座途径、染色体内同源重组、目标基因与标记基因共转化、位点专一 性重组等措施来剔除标记基因，最通用最广泛的是位点专一重组途径，首先构建含有位点 专一重组系统Cre/LoxP的标记基因删除植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法将删除系 统整合到柑橘基因组中，随后诱导表达控制重组系统Cre基因表达来删除筛选标记基因， 最终获得只含外源目的功能基因的无标记转基因柑橘再生芽。 现有的删除转基因柑橘中筛选标记基因的操作如下： 首先采用1个结合化学诱导系统XVE和位点专一性重组系统Cre/LoxP的标记基 因删除载体，通过农杆菌介导法对柑橘上胚轴茎段进行无选择标记遗传转化，对侵染后茎 段接种在MS+3mg/L6-BA培养基上，共培养3天后转移到筛选培养基（MS+75mg/L卡那霉素 +500mg/L头孢霉素）中，筛选培养21天后可观察到抗性芽萌发，切下带1~2_外植体的 抗性芽，转移至含有雌二醇的化学诱导培养基（MS+3mg/L6-BA+500mg/L头孢霉素+2 ymol/ L雌二醇）上诱导，15d后用荧光显微镜观察，成功观测到绿色荧光.继续诱导培养30天 后，进行试管嫁接，30天后，提取接穗基因组DNA进行PCR扩增，检测到DNA的切除现象，获 得无选择标记转基因植株。目前对这种再生芽继续培养成植株的方法通常是采用茎尖试管 嫁接获得再生植株，详细步骤如下：以14天试管无菌实生苗为嫁接砧木，嫁接时，将无菌砧 木苗切去下胚轴端部保留约4~6cm长，切去上胚轴顶部留约2~4cm长，顶端劈口。切取 再生生长了 45天长约0. 3~0. 5cm的再生芽，基部斜切，插入砧木的劈口处，对齐形成层。 置于包含滤纸桥的液体嫁接培养基中培养，30天后嫁接苗伸长约2cm时，称取100mg叶片 (大约一片叶）常规法微量提取DNA，进行PCR检测后才能嫁接至温室中进行后期转基因安 全性评价。 采用上述方法存在以下缺陷： 缺陷1 :再生培养基中需要添加75mg/L kan，诱导培养中需要添加2 y mol/L雌二 醇，这些外源化学物质的添加影响了再生芽的萌发及生长，从上胚轴茎段农杆菌侵染后，需 要21天才能萌芽，这些芽转入添加2 y mol/L雌二醇的诱导培养基中，诱导培养45天后，总 共要花66天后再生芽才能进行试管嫁接，从而延缓转基因再生苗的获得。 缺陷2 :再生芽嫁接成苗生长过程中需多次对砧木抹芽，工作量大，且容易污染 时，从而延缓转基因再生苗的获得。而且茎尖嫁接操作复杂：嫁接3天后，从砧木切口处会 长出很多再生芽，与接穗芽愈合生长产生竞争，如果不及时抹去从砧木上长出的再生芽，接 穗芽一般竞争不过从砧木上长出的再生芽，几天后接穗芽就会萎黄枯死，而且，抹过一次的 砧木再生芽还会继续萌发二，三，四次至多次再生芽，需要反复抹3~4次砧木芽，直至接穗 芽长出3~4片叶（约2cm)可用于PCR检测，当面对几百上千个转化再生芽时需要进行茎 尖嫁接，其工作量大，操作复杂，且容易污染。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是获得无选择标记转基因柑橘的周期长、工作量大。 本专利技术提供了可删除筛选标记基因的植物表达载体，载体包括Cre/Loxp系统；该 Cre/Loxp系统为在2个loxP位点间构建ipt基因表达元件和Cre重组酶表达元件。 优选的，所述的载体还包括目标基因表达元件，该表达元件从5'至3'方向依次包 括启动子、目标基因和终止子。 具体的，所述ipt基因具有如SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列。 优选的，Cre重组酶的编码基因中加入了枳早期结瘤素样基因PtBCPl的内含子， 具有如SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列。 具体的，所述的Cre/Loxp系统具有如SEQIDNo. 3所述的核苷酸序列。 本专利技术还提供了含有所述植物表达载体的宿主细胞。 具体的，所述的宿主细胞为农杆菌。 本专利技术还提供了所述植物表达载体在获得无筛选标记基因的转基因植物中的用 途。 本专利技术还提供了所述宿主细胞在获得无筛选标记基因的转基因植物中的用途。 本专利技术还提供了快速获得无选择标记转基因柑橘的方法，包括如下步骤： a、遗传转化：将构建好的可删除标记基因的植物表达载体转化农杆菌，采用 农杆菌介导法对lcm~1. 5cm柑橘上胚轴茎段进行侵染，侵染后茎段接种在MS+2mg/L BA+0.5mg/L IAA+lmg/L 2,4-D+0.1mmol/L AS共培养基上，共培养2~3天后转移到含 500mg/L Carb的MS再生培养基中继续培养； b、嫁接：在MS培养基中培养10~20天后可观察到再生芽的萌发，25~35天后 再生芽可长至〇? 5~lcm，进行试管茎尖嫁接，嫁接苗继续培养10~20天后可长至2cm，提 取嫁接苗叶片DNA，进行PCR检测，获得无选择标记转基因植株。具体的，步骤b中所述的试管茎尖嫁接操作如下：将封口用的石蜡带封口膜切成 0. 1~0. 2cm宽、拉成2~3cm长的带状，于纯酒精中浸泡过夜，嫁接前，从酒精中捞出平铺 在灭菌培养皿于超净台上吹干酒精备用；把再生芽插入砧木的劈口处后，用准备好的石蜡 带将砧木切口与接芽接处的地方包缠2圈，继续置于试管MS培养基上培养。 本专利技术中，BA即6-苄基腺嘌呤；IAA即3-吲哚乙酸；2, 4-D即2, 4-二氯苯氧乙 酸；AS即乙酰丁香酮。 本专利技术中，Cre/Loxp系统是在大肠杆菌噬菌体P1中发现的位点特异性重组系统， 由Cre重组酶和loxP位点2部分组成，Cre重组酶是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白， loxP是一种典型的回文序列结构，长本文档来自技高网...
【技术保护点】
可删除筛选标记基因的植物表达载体，其特征在于：该载体包括Cre/Loxp系统；该Cre/Loxp系统为在2个loxP位点间构建ipt基因表达元件和Cre重组酶表达元件。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许兰珍，邹修平，彭爱红，陈善春，何永睿，雷天刚，姚利晓，姜国金，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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