用交叉β结构靶向诱导蛋白质聚集制造技术

本发明专利技术属于蛋白质聚集领域。本发明专利技术公开了用于干扰靶蛋白功能的方法，使用称为聚集剂的非天然的、用户设计的分子，其具有对靶蛋白的特异性并且在与所述靶蛋白接触时诱导聚集。本发明专利技术还公开了这种聚集剂分子及其治疗和诊断应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】用交叉β结构靶向诱导蛋白质聚集 本申请为2008年6月3日提交的、专利技术名称为"用交叉β结构靶向诱导蛋白质聚 集"的PCT申请PCT/EP2008/056825的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为 2010年2月3日，申请号为20088010184L 4。 专利
本专利技术属于蛋白质聚集领域。本专利技术揭示了干扰靶蛋白质功能的方法以及使用被 称作聚集剂（aggregator)的非天然的、使用者设计的分子，其对靶蛋白质具有特异性且在 与所述靶蛋白质接触时诱导聚集。本专利技术还揭示了这种聚集剂分子及其在治疗和诊断中的 应用。 专利技术背景 蛋白质聚集已经成为生物技术和医学领域的主要议题。其是蛋白质生产中的主 要瓶颈，缩小了通过重组技术获得的相关多肽的范围；其降低存放期且可以增加多肽药物 的免疫原性；以及其与人类关键疾病的数目增加相关，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、海绵 状脑病、II型糖尿病以及帕金森氏病。最近十年数据已经开始不断提示多肽的组成和一级 结构在很大程度上决定其聚集倾向，且较小的改变对于溶解性可能具有巨大影响。如通过 能预测蛋白质中β-聚集序列的很多算法证实，根据其序列预测蛋白质聚集倾向的能力非 常具有价值。这些算法可用于通过特异性序列靶向治疗剂控制不希望的蛋白质沉积事件 或者揭示生物技术感兴趣蛋白的更可溶的变体。通常假定不是多肽的所有区域在决定其 聚集倾向中均是相同重要的。在这方面，最近已经证实极短的一段特殊氨基酸序列可作为 淀粉样原纤维形成的促进剂或抑制剂。在功能蛋白质组学领域需要开发创新技术以促进 专利技术及使功能蛋白质组学中通过互补方法赋予的潜力最大化。需要具有一种可灵活应用 的技术，其可以直接革巴向特定胞外或胞内蛋白质的生物学功能，而不是革巴向翻译其的mRNA 或者操作编码其的基因。在本专利技术中我们尝试开发基于聚集而靶向特定蛋白质的技术。 迄今为止，蛋白质聚集主要作为不希望的导致疾病的现象而被研宄，且普遍认为交叉-β 介导的聚集是最经常发生的且是聚集的生物学相关机制2。交叉聚集（Cross-beta aggregation)是用于表示聚集是通过分子间β-折叠形成而成核（nucleated)的术 语，聚集物中的每个分子均提供典型包含至少三个连续氨基酸的相同的链。专利申请 W003102187(Scegen, Pty Ltd)揭不了通过将分子与膜易位序列（membrane translocating sequence)融合而增强所述分子活性的方法，从而所得嵌合分子自主装配成较高分子量的 聚集物。US20050026165(Aret6 Associates)揭示了能与不溶蛋白质如朊病毒的β-折叠 构象相互作用的构象肽作为朊病毒疾病诊断工具的应用。专利申请W02007010110描述了 通过使用多环化合物诱导蛋白质聚集。 专利技术概述 本专利技术涉及特定靶蛋白质的受控且可诱导的蛋白质聚集的技术。本专利技术还提供了 重新设计的分子，在本文称作聚集剂分子，其包含与对于靶蛋白质具有亲和性的结合区偶 联的至少一个β -聚集区。在一个优选的实施方案中，所述聚集剂分子包含至少一个β -聚 集区，其与能结合靶蛋白质（或者与之相互作用）的区域融合。在选择的靶蛋白质与特殊 设计的聚集剂分子接触时，在所述靶蛋白质与聚集剂之间出现特异性共聚集，导致所述靶 蛋白质的生物学功能的功能性敲除或者下调。这种蛋白质敲低（knock-down)是取决于聚 集剂的存在的，其由存在聚集剂分子而被诱导。另一额外的优势是蛋白质干扰的强度可以 通过改变聚集剂分子中β-聚集区的数目而实验性地控制。本专利技术不仅提供了下调特定胞 外或胞内蛋白质生物学功能的有效研宄工具，而且也具有重要的治疗、农业和诊断应用。【附图说明】 图1:该图示出通过离心除去共聚集物之后上清中残余HRP活性百分比（见实施 例1)。所述聚集剂（生物素酰化肽）的存在显然从可溶级分中除去了所述酶。 专利技术目的和详细描述 在本专利技术中，我们开发了通过使用非天然发生的分子下调蛋白质的生物学功能的 方法，所述分子包含能结合所述蛋白质的区域及至少一个聚集序列。在与靶蛋白质接 触时，所述非天然发生的分子与所述靶蛋白质之间发生共聚集。所述聚集使得靶从其可溶 环境中退出，导致所述可溶靶蛋白质的功能性敲低。"聚集"应理解为可以是指无定形或者 纤维状（淀粉样或者交叉纤维状是相同含义术语）聚集。事实上，聚集区的种类 决定靶蛋白质的无定形或纤维状聚集的诱导。 因此，本专利技术的一个实施方案提供了下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述 蛋白质与非天然发生的分子接触，所述分子包含能结合所述蛋白质的区域以及至少一个 β-聚集序列。文中用语"能结合靶蛋白质"是指"能与靶蛋白质相互作用"或者换言之是 "对于靶蛋白质具有亲和性"。应理解所述亲和性是在微摩尔至皮摩尔亲和性的范围内，优 选在纳摩尔至皮摩尔亲和性的范围内。因此聚集剂（或者其能结合靶蛋白质的结合结构 域）对于靶蛋白质的亲和性为至少IO 4Hior1 (例如至少105、106、107、108、10 9、10'IO11或者 IO12moΓ1)。应理解这种非天然发生的分子是嵌合分子，其包含两个元件的融合：结合区与 至少一个β-聚集序列，所述两个元件彼此无亲和性和/或所述元件彼此不结合。无亲和 性是指该亲和性低于高于IO 4Hi0I'在一个优选的实施方案中，所述元件与靶蛋白质不同， 其目的在于下调（或者等价而言：其目的在于聚集）。在另一优选的实施方案中，所述结合 区可以调节靶蛋白质的功能。在再一优选的实施方案中，所述结合区不调节靶蛋白质的功 能，意味着所述结合区（当单独结合时）仅结合靶蛋白质而不干扰所述靶蛋白质的生物学 功能。在一特殊的实施方案中，靶蛋白质是融合蛋白，如组氨酸融合蛋白、链霉抗生物素蛋 白融合蛋白、GFP融合蛋白等。 术语"结合区"或者"结合结构域"典型是指与靶蛋白质相互作用的分子。在某 些情况中，结合结构域是化学化合物（例如对至少一种靶蛋白质具有亲和性的小化合物）； 在其他某些情况中，结合结构域是多肽；在其他某些情况中，结合结构域是蛋白质结构域。 蛋白质结合结构域是整个蛋白质结构的元件，其是自稳定的且通常不依赖于其余蛋白质 链而折叠。结合结构域的长度可以在大约25个氨基酸直至500及更多个氨基酸的范围 内变化。许多结合结构域可以分类为折叠及可识别的、可鉴别的3-D结构。一些折叠在 许多不同蛋白质中很常见，以致于给其特定名称。非限制性的例子是罗斯曼折叠、TIM桶、 执餘（armadillo)重复、亮氨酸拉链、1?粘蛋白结构域、死亡效应结构域（death effector domain)、免疫球蛋白样结构域、磷酸酪氨酸-结合结构域、血小板-白细胞C激酶底物同系 结构域、src同源2结构域、BRCAl的BRCT结构域、G-蛋白结合结构域、Eps 15同源（EH) 结构域以及P53的蛋白质结合结构域。抗体是具有通过称作互补决定区（CDR)的超变环区 介导的特异性的特异结合蛋白的天然原型。尽管通常抗体样支架已证明作为特异结合剂工 作良好，但是已经清楚其不必须与展示CDR样环的刚性支架范例（paradigm)严格粘合。除 了抗体之外，许多其它天然蛋白质介导结本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够下调蛋白质的生物学功能的嵌合分子在制备药物中的应用，所述嵌合分子包含能结合所述蛋白质的区域及至少一个β‑聚集序列，其中所述能结合所述蛋白质的区域选自免疫球蛋白或免疫球蛋白样结构域以及基于生物素‑抗生物素蛋白高亲和性相互作用的特异性的结合结构域。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J·希姆科维兹，F·鲁索，
申请(专利权)人：弗拉芒区生物技术研究所，布鲁塞尔自由大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE