本发明专利技术属于生物医学领域，涉及一种鸟氨酸脱羧酶(ODC)的小分子抑制剂及其应用；通过计算机辅助的高通量药物筛选，发现针对鸟氨酸脱羧酶(ODC)的新型小分子抑制剂，验证其效果，发现对ODC具有良好的抑制作用，尤其可用于抑制人源ODC，预防、治疗和诊断肿瘤疾病、病原微生物感染，研发制备肿瘤药物或病原微生物感染类药物。
【技术实现步骤摘要】
小分子抑制剂及在抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)上的应用
本专利技术属于生物医学领域，涉及一种鸟氨酸脱羧酶(ODC)的小分子抑制剂及其应用；具体涉及人源鸟氨酸脱羧酶的小分子抑制剂及其在抑制和杀伤肿瘤细胞中的应用。
技术介绍
蛋白质是生物体的主要组成成分之一，是完成各种生命活动的主要物质。在各种蛋白质中，蛋白酶对生命活动至关重要，几乎所有生物体内的生化反应过程都由蛋白酶进行催化。生物体内各种蛋白酶的活性具有严格的调控机制，一旦其调控机制出现问题，造成蛋白酶的活性过高、过低或者是完全失活，都会造成相应的各类疾病。因此，通过药物来调控蛋白酶的活性，使其恢复和保持在正常水平，具有非常重要的理论意义和现实意义。以结构为基础的药物设计，是设计以蛋白质为靶标的药物的一个非常重要的手段。多胺(polyamines)是一类从氨基酸代谢产生的带正电的阳离子小分子，在所有生物体中都存在，对细胞生长、分化、存活及正常生物学功能等都不可缺少。多胺带多正电荷的特性，使它们能通过与带负电荷的生物大分子(DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等)形成静电作用，从而调控非常广泛的生物学过程，包括染色体结构形成、DNA合成与稳定、DNA复制、转录和翻译、蛋白质磷酸化、核糖体生成、离子通道和膜表面受体的调控、自由基清除等。天然的多胺有很多种。在哺乳动物中，天然存在的有三种，即腐胺(putrescine)，精脒(spermidine)，精胺(spermine)，它们对哺乳动物正常生长和发育必不可少。由于多胺具有重要的生物学功能，其细胞内水平受到严格的调控。在快速繁殖的细胞中，如肿瘤细胞，多胺水平及ODC表达水平也会上升和失调。多胺水平升高，伴随着细胞增殖加快、凋亡减少、以及肿瘤浸润和转移相关基因的表达水平升高等。因此，多胺的调控，成为肿瘤治疗和药物研发中的一个重要手段。多胺代谢的起始底物是鸟氨酸(ornithine)，它是精氨酸在尿素循环(ureacycle)中被精氨酸酶(arginase)催化的反应产物。ODC是多胺合成途径的第一个酶，催化从鸟氨酸(ornithine)到腐胺的反应，该步催化反应也是多胺合成途径的一个限速步骤。因此，合成ODC抑制剂，抑制腐胺的生成，是目前很受关注的一个肿瘤治疗途径。同时，由于病原微生物也需要正常的多胺水平，ODC抑制剂也成为针对病原微生物(如导致非洲锥虫病的布氏锥虫)的重要靶标。当前，ODC的抑制剂DFMO(α-二氟甲基鸟氨酸)已经被用于临床，辅助癌症的化疗。但其与ODC的结合能力较弱，作用浓度很高，且由于是与ODC形成共价键的自杀性抑制剂，毒副作用非常大。因此，非常有必要开发出具有更好效果的ODC新型抑制剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过计算机辅助的高通量药物筛选，提供一种针对ODC的新型小分子抑制剂，将其应用于鸟氨酸脱羧酶的抑制剂，可能可以用作制备治疗肿瘤、病原微生物感染的药物。具体为：一种小分子抑制剂，其特征在于，该小分子抑制剂的结构式为：其中，R1，R2为R3为采用上述任意一种小分子抑制剂在抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)上的应用。采用上述任意一种小分子抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。采用上述任意一种小分子抑制剂在制备治疗病原微生物感染药物中的应用。将上述小分子抑制剂用于抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)的方法，包括如下步骤：1)ODC原核表达质粒的构建将ODC的基因序列，通过BamHI和XhoI酶切位点，插入到pET28a质粒中，构建出pET28a-hODC质粒，经DNA测序验证；2)ODC蛋白的表达将步骤1)构建的pET28a-hODC质粒通过CaCl2法，转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过卡那霉素进行筛选，然后将在含有卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养板上生长的菌株，接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm培养至对数生长期，再添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至0.5mM，在28℃诱导表达4小时，最后，离心收集细菌；3)ODC蛋白的纯化将步骤2)中收集的细菌，用裂解液重新悬浮，然后通过超声方法进行细胞裂解，再将裂解液在4℃、12000转/min，离心后，保留上清；最后将上清利用Ni-NTAHis标签蛋白结合填料进行结合和纯化，得到人源ODC蛋白，ODC蛋白的洗脱缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)/HCl,pH8.0，300mMNaCl，1mMDTT，100mM咪唑(imidazole)；4)ODC蛋白的活性检测在EP管中，加入400uL底物反应混合物、50ug的ODC蛋白，混匀后将EP管放置在37℃水浴中30min；加入400uL10％的三氯乙酸终止反应，室温离心5000rpm、5min，然后取出100uL上清，与200uL4mol/L的NaOH溶液混合，加入400uL正戊醇，充分混合，2000rpm离心5min，再将上层液200uL转移至新的EP管中，加入200uL0.1mol/LpH为8.0的四硼酸钠混合均匀、加入200uL10mmol/L三硝基苯磺酸混合充分、加入400uLDMSO，充分混合1min，3000rpm离心5min；最后取出上层液到96孔板中，用酶标仪检测426nm处的吸光值，得到未加酶的OD值；5)抑制剂对ODC蛋白的抑制活性的检测根据步骤4)中所述的方法，在加入400uL底物反应混合物后，随即加入鸟氨酸脱羧酶的小分子抑制剂，后续操作同步骤4)；通过以下公式计算出ODC抑制率：对照差＝加小分子抑制剂对照组平均OD值-未加小分子抑制剂对照组平均OD值，其中对照组在步骤5)中加入的抑制剂为DFMO抑制剂；实验差＝加小分子抑制剂实验组平均OD值-未加小分子抑制剂实验组组平均OD值；ODC抑制率＝[(对照差-实验差)/对照差]×100％。所述的步骤3)中所述的裂解液为50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)/HCl,pH8.0，300mMNaCl，1mMDTT，1mMPMSF，5mM咪唑(imidazole)的混合液。所述的步骤4)中的底物反应混合物为在150mMpH为7.1的磷酸盐缓冲液(PBS)中溶解17.57ulβ-巯基乙醇，55.84mg1.5mMEDTA二盐钠，75nM磷酸吡哆醛(PLP)储液，2mM鸟氨酸盐酸盐。所述的鸟氨酸脱羧酶为人源鸟氨酸脱羧酶、非人源鸟氨酸脱羧酶或与人源鸟氨酸脱羧酶的腐胺底物及磷酸吡哆醛结合位点高度同源的蛋白质。按照以上方案，首先利用Pocket蛋白质药物口袋分析软件，以人源ODC的晶体结构为基础，对其腐胺底物及PLP配体结合口袋进行分析，并产生一个该蛋白质口袋的理论模型。然后，利用蛋白质对接程序DOCK，将SPECS小分子药物库中的19万个小分子，对接到上述蛋白质口袋模型中，并筛选出至少含15个非氢重原子、至少形成2个氢键、至少1个疏水中心、对接打分不超过-10的小分子。再对上述小分子进一步利用蛋白质-小分子对接程序Autodock，再一次依次对接到上述蛋白质口袋中，进行进一步的对接计算，最后挑选出对接打分低于-7的小分子。本专利技术还提供一种组合物，其含有对抑制鸟氨酸脱羧酶有效量的本专利技术提供的小分子抑制剂或其类似物和药学上适用的载体。优选所述组合物是药物组合物，其含有对治疗有效量的本专利技术提供的小分子抑制剂或其类似物和药学上本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小分子抑制剂，其特征在于，该小分子抑制剂的结构式为：其中，R1，R2为或R3为
【技术特征摘要】
1.一种筛选具有抑制鸟氨酸脱羧酶(ODC)活性的小分子抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)ODC原核表达质粒的构建将ODC的基因序列，通过BamHI和XhoI酶切位点，插入到pET28a质粒中，构建出pET28a-hODC质粒，经DNA测序验证；2)ODC蛋白的表达将步骤1)构建的pET28a-hODC质粒通过CaCl2法，转化到大肠杆菌BL21菌株中，通过卡那霉素进行筛选，然后将在含有卡那霉素的Luria-Bertani培养板上生长的菌株，接种至含有卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm培养至对数生长期，再添加异丙基硫代半乳糖苷至0.5mM，在28℃诱导表达4小时，最后，离心收集细菌；3)ODC蛋白的纯化将步骤2)中收集的细菌，用裂解液重新悬浮，然后通过超声方法进行细胞裂解，再将裂解液在4℃、12000转/min，离心后，保留上清；最后将上清利用Ni-NTAHis标签蛋白结合填料进行结合和纯化，得到ODC蛋白，ODC蛋白的洗脱缓冲液为50mM三羟甲基氨基甲烷/HCl,pH8.0，300mMNaCl，1mMDTT，100mM咪唑；4)ODC蛋白的活性检测在EP管中，加入400μL底物反应混合物、50μg的ODC蛋白，混匀后将EP管放置在37℃水浴中30min；加入400μL10％的三氯乙酸终止反应，室温离心5000rpm、5min，然后取出100μL上清，与200μL4mol/L的NaOH溶液混合，加入400μL正戊醇，充分混合，200...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘森，占景琼，王艳林，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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