桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用制造技术

桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO及其应用，所述基因、蛋白的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。所述非生物胁迫为干旱、高盐ABA、SA胁迫。所述植物为桑树(Morus multicaulis)。本发明专利技术技术方案可以标识植物是否处于干旱、高盐ABA、SA等生长环境。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，涉及到一种桑树贝壳杉烯氧化酶基因克隆和其在 胁迫条件下的表达应用。
技术介绍
在植物的生长过程中植物激素的作用是十分重要的，赤霉素（GA)是众多重要的 植物激素之一。赤霉素影响着高等植物生活史的各个阶段，如种子萌发，茎的伸长，花器官 的诱导和发育以及种子和果实的形成。GA与植物的伸长生长密不可分，当GA的生物台成途 径或感受途径发生阻塞之后，植物就会发生矮化，其矮化的程度取决于受阻步骤在途径中 的先后位置。如受阻部位发生在合成途径较早的K0 (贝壳杉烯氧化酶）或KS(贝壳杉烯合 成酶）位点上，得到的植株将是极其矮化的类型，并可能不育（不开花或者不能形成果实）： 若受阻部位发生在合成途径较晚的步骤上时.则会得到半矮化的植株.植株的矮化与果树 的产量和品质息息相关. 栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸（GGPP)是合成赤霉素（GA)的前体。GGPP在古巴焦磷酸 合成酶（GPS)和贝壳杉烯合成酶（KS)催化下环化为赤霉素的前身贝壳杉烯。贝壳杉烯的 C-19的甲基在K0催化下不断被氧化，分别形成贝壳杉烯醇、贝壳杉烯醛和贝壳杉烯酸。贝 壳杉烯酸再次分支，形成3种产物，一种是GA12-醛，它是GA的最初产物。GGPP在古巴焦磷 酸合成酶（GPS)和贝壳杉烯合成酶（KS)催化下环化为赤霉素的前身贝壳杉烯。贝壳杉烯 的C-19的甲基在K0催化下不断被氧化，分别形成贝壳杉烯醇、贝壳杉烯醛和贝壳杉烯酸。 贝壳杉烯酸再次分支，形成3种产物，一种是GA12-醛，它是GA的最初产物。 因此K0是赤霉素生物合成途径中的关键酶，位于早期未分支的合成步骤上，催化 3步氧化反应，即由贝壳杉烯氧化成贝壳杉烯醇，继而形成贝壳杉烯醛，再被氧化成贝壳杉 烯酸，这是一系列的单加氧过程，此酶属于膜结合的依赖细胞色素P450和NADPH的单加氧 酶。K0是新类型的P450酶。所有高等植物含有贝壳杉烯氧化酶（K0)，同时也是细胞色素 P450 (CYP) 701家族成员（本专利实验结果在线软件分析验证得知）P450是一类以还原态与C0结台后在波长450nm处有吸收蜂的含血红素的单链蛋 白质。因为P450酶系在生物体中具有重要的功能，对许多内源性和外源性的化学物质尤其 是对环境有害化学物质存在氧化代谢作用，而受到广泛的重视。 近年来进一步的研宄表明，贝壳杉烯氧化酶基因在赤霉素的合成中起到重要的作 用，参与高等植物的氧化代谢与合成，但目前关于K0基因是否参与植物的环境胁迫反应还 不清楚。 我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者 几十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果 用价值、药用价值、经济价值等。我们用已克隆得到的鲁桑品种（Morusmulticaulis)育 71-1MK0基因全长序列。通过生物信息学分析其序列特征。同时，利用荧光定量PCR的方法 检测了MK0在干旱、盐、ABA、SA胁迫条件下的转录水平的变化规律。通过对该基因的研宄， 使我们从分子水平了解到桑树K0基因在不同胁迫条件下的表达情况
技术实现思路
解决的技术问题：本专利技术提供一种，可以用于 桑树中的贝壳杉烯氧化酶基因在环境胁迫下的表达调控。 技术方案：桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO,序列如SEQIDN0. 2所示。 编码桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因，序列如SEQIDNO. 1所示。 上述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO在作为植物非生物胁迫表达标志物中的应用。 上述编码桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO的基因在作为植物非生物胁迫表达标志物中 的应用。 所述非生物胁迫为干旱、高盐ABA或SA胁迫。 所述植物为桑树（Morusmulticaulis)。 有益效果：贝壳杉烯氧化酶是赤霉素生物合成途径中的关键酶，位于早期未分支 的合成步骤上，催化3步氧化反应，即由贝壳杉稀氧化成贝壳杉稀醇，继而形成贝壳杉稀 醛，再被氧化成贝壳杉烯酸，这是一系列的单加氧过程，此酶属于膜结合的依赖细胞色素 P450和NADPH的单加氧酶。K0是新类型的P450酶。所有高等植物含有贝壳杉烯氧化酶 (K0)，同时也是细胞色素P450 (CYP) 701家族成员。在植物的种子萌发，茎的伸长，花器官的 诱导和发育以及种子和果实的形成发挥重要的作用。同时同为P450酶系，在生物体中具有 重要的功能，对许多内源性和外源性的化学物质尤其是对环境有害化学物质存在氧化代谢 作用。本专利技术所述桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO,完善桑树基因组同时提供了桑树贝壳杉烯氧 化酶在非生物胁迫条件的表达分析和应用。【附图说明】 图1为桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的0RF扩增结果图；M. 2000bpDNA分子标 记1.RT-PCR产物； 图2为桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的3' -RACE扩增结果图；5'RACE扩增结 果：M. 2000bpDNA分子标记；1PCR扩增产物； 图3为桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因推导的氨基酸序列保守区预测软件截图； 图4为定量RT-PCR检测MmKO基因在盐胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；1.对 照，2.盐处理6小时，3.盐处理12小时，4.盐处理1天，5.盐处理2天，6.盐处理4天， 7.盐处理16天；每组数据左侧为盐实验处理组，右侧为对照组； 图5为定量RT-PCR检测MmKO基因在干旱胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图； 1.对照，2.干旱处理2d，3.干旱处理4d，4.干旱处理8d，5.干旱处理10d，6.干旱处理16d; 每组数据左侧为干旱实验处理组，右侧为对照组； 图6为定量RT-PCR检测MmKO基因在ABA胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图； 1.对照，2.ABA处理1小时，3.ABA处理2小时，4.ABA处理4小时，5.ABA处理6小时，6.ABA 处理8小时，7.ABA处理10小时，8.ABA处理1天，9.ABA处理2天，10.ABA处理3天；每组 数据左侧为ABA实验处理组，右侧为对照组； 图7为定量RT-PCR检测MmKO基因在SA胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；1.对 照，2.SA处理1小时，3.SA处理2小时，4.SA处理4小时，5.SA处理6小时，6.SA处理8小 时，7.SA处理10小时，8.SA处理1天，9.SA处理2天，10.SA处理3天；每组数据左侧为SA 实验处理组，右侧为对照组。【具体实施方式】 实施例1桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因的克隆 供试桑树品种为保存于中国农业科学院蚕业研宄所国家种质镇江桑树圃的育 71-1。利用已获得的包含桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO基因cDNA片段的ESTs序列，设计引物， 并加以验证，引物序列如下：MmK0-F：5, -ATTATTTGTTGTCCGAAGC-3r ；MmKO-R： 5r -ACAGTCCTGCCGTTTTG-3r ； 根据已克隆并验证的基因中间片段结果，设计3'RACE扩增所需目的基因的上游 特异性引物，引物序列如下：GSP1 ： 5r -TGTGGATTATTTGTTGTCCGAAGC-3r 根据已克隆3'RACE产物验证序列结果，设计5RACE扩增所需目的基因的下游特 异性引物，引物序列如下： GSP2 ： 5r-GTTCGTACATTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
桑树贝壳杉烯氧化酶MmKO，其特征在于序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵卫国，李凤，钱姣，周宏，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32