本发明专利技术涉及基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用，EST-SSR标记为SCRC371。本发明专利技术还涉及EST-SSR标记引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用。本发明专利技术所述的基于陆地棉茎尖转录组序列开发出的EST-SSR引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富等优点，可有效用于棉花种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定、分子标记辅助育种等研究领域。
【技术实现步骤摘要】
基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用本案为申请号201410284580.1的分案申请
本专利技术涉及基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用，特别涉及基于陆地棉Coker312茎尖转录组序列开发的EST-SSR引物及其应用，属于分子标记
技术介绍
棉花是重要的经济作物之一，也是最重要的纺织纤维作物。其栽培种有4个,包括2个二倍体棉种,即草棉(Gossypium.herbaceum)和亚洲棉(G.arboreum)以及2个四倍体棉种,即陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)。由于陆地棉的产量高,适应性的特点，使之成为栽培种中的重要品种。但目前育成的陆地棉品种多样性水平降低，遗传基础狭窄，导致在生产上难以区分和识别，从而制约着产量和品质的进一步提高。随着基因组学的发展，分子标记成为改善这一问题的首选方法。简单重复序列(SSR)是一种高度多态和共显性标记，因而被广泛用于分子标记遗传分析。随着高通量测序技术的发展,许多物种中已开发出大量的转录组数据,这些数据在新标记的开发和应用过程中具有重要意义。萝卜(RaphanussativusL.),辣椒(CapsicumannuumL.),芝麻(SesamumindicumL.)等作物中转录组数据的挖掘，为其识别和开发新的EST-SSR标记提供可靠性。目前利用转录组序列开发新的分子标记在棉花中已有应用，来德勇等利用陆地棉花发育相关的转录组数据发掘了670个新的EST-SSR标记；陈浩东等从达尔文氏棉转录组序列中开发了780对EST-SSR引物，并详细分析了EST-SSR位点的特征，引物的多态性及可转移性；吕远大等基于海岛棉纤维发育EST序列开发出380对SSR引物；Jena等在草棉转录组99780个Unigene中，查找出12471个SSR位点，分布于8900条EST中。目前，棉花中开发的EST-SSR主要与纤维发育基因相关，与棉花早期形态建成相关的基因SSR标记开发尚未见报道。茎端组织与植物叶原基、芽原基的发生以及植物顶端生长优势密切相关，开发与此相关的EST-SSR既能增加棉花EST-SSR标记的数量，又能深入探究EST-SSR标记基因的功能。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种基于陆地棉转录组序列开发的EST-SSR标记引物与应用。基于陆地棉茎尖转录组序列开发出的EST-SSR引物具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富等优点，可有效用于棉花种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定、分子标记辅助育种等研究领域。本专利技术的技术方案如下：一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC056的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。上述EST-SSR标记SCRC056的引物在遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM处，位于chr.16(D7)上15.4cM的标记BNL2734与chr.16(D7)上24.4cM的标记CGR6280之间，与标记BNL2734相距5cM，与标记CGR6280相距4cM。一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC371的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。上述EST-SSR标记SCRC371的引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM处，位于chr.18(D13)上52.7cM的标记SHIN1403与chr.18(D13)上78.4cM的标记CGR5021之间，与标记SHIN1403相距10.5cM。一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC878的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。上述EST-SSR标记SCRC878的引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM处，位于连锁群末端,与位于chr.2(A2)上35.5cM的标记HAU880距离最近，相距7.0cM。一种陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC1022的引物，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。上述EST-SSR标记SCRC1022的引物在棉花遗传多样性分析和高密度遗传图谱构建方面的应用，标记SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM处，位于chr.23(D9)上16.6cM的标记CGR5392与chr.23(D9)上24.4cM的标记HAU2017之间，与标记CGR5392相距2.9cM，与标记HAU2017相距4.9cM。上述的EST-SSR标记的引物进行棉花遗传多样性分析的方法，步骤如下：(1)DNA提取利用改良的CTAB法提取待测样品总DNA(2)引物扩增及电泳检测以步骤(1)提取的待测样品为模板，利用上述引物进行PCR扩增；扩增产物采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，银染显色。PCR体系(10μL)包括1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μL(20～50ng)DNA模板，加无菌蒸馏水至10μL。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃45s，(Tm)℃45s,72℃45s,共32个循环；72℃延伸7min；25℃保存。PCR产物加入2.0μL溴酚蓝后点样，采用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。电泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸电泳系统中进行。取1.2μL样品，以Takara20bpDNALadderMarker为DNA分子量标准，300W恒功率电泳40min，银染显色。(3)数据统计。采用两种数据统计的方法：①记录多态性位点。根据DNA分子量标准和引物扩增结果统计数据。同一等位点出现清晰条带记录为“1”，无条带记录为“0”；②差异性条带记录。以引物在亲本中扩增出的条带为标准，亲本1的带型记录为“1”，亲本2的带型记录为“2”，出现于亲本带型不一样的第一种带型记录为“3”，以此类推。所述遗传多样性分析为：采用上述(3)中①方法统计的数据，利用PopGene32计算引物的多态性信息含量(PIC)。所述高密度遗传图谱的构建是采用上述步骤(3)中②记录的数据采用Jion-Map4.0软件构建分子遗传连锁图谱(LOD值＝6.5)，以Kosambi函数作图；采用MapChart2.2绘图软件绘制遗传图谱。有益效果本专利技术所述的EST-SSR引物均来自陆地棉茎尖转录组序列，与以往的陆地棉纤维相关的转录组中开发出的SSR引物存在功能差别，所述的引物在陆地棉茎尖转录组中分布均匀、多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，并且成功连锁到高密度遗传图谱上，丰富了陆地棉基于转录组发掘SSR引物的数量，可有效用于棉花种质资源遗传多样性分析、高密度图谱的构建、品种纯度和真实性鉴定。附图说明图1为SSRLocator软件本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种陆地棉Coker312的EST‑SSR标记SCRC371的引物，其特征在于，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
【技术特征摘要】
1.一种基于陆地棉茎尖转录组序列的陆地棉Coker312的EST-SSR标记SCRC371的引物，其特征在于，该引物为一对，核苷酸序列分别为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。2.权利要求1所述的EST-SSR标记SCRC371的引物在棉花遗传多样性分析和...
【专利技术属性】
技术研发人员：张军，高阳，王芙蓉，刘国栋，张传云，张景霞，周娟，
申请(专利权)人：山东棉花研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37
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