一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子及其制备方法，本发明专利技术的用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1或3。利用本发明专利技术的方法可以快速制备大量的双链RNA，低成本，高效率，制备方法操作简便。同时，本发明专利技术筛选的核苷酸片段能达到很好的干扰效率，能够有效的干扰罗氏沼虾雄性生殖系统的发育。同时，利用本发明专利技术制备的双链可以在虾类动物体内实现长期、高效的基因沉默，为虾类功能基因的研究提供较好的技术手段和方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核酸分子及其制备方法
本专利技术属于基因缺失失活
，具体涉及一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子，可用于罗氏沼虾雄性生殖相关的RNA干扰研究。
技术介绍
RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术作为一种基因功能研究的重要手段，已被广泛用于探索虾蟹动物的基因功能领域。RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能领域。目前，RNA干扰技术主要是利用小干扰RNA(siRNA)来实现基因沉默，其制备方法主要有化学合成，体外转录和体内表达三种，各有利弊。化学合成方法能制备高质量的RNA干扰样品，但价格高，定制周期长；体外转录方法合成，成本相对较低，但实验的规模和量受到限制，不适用于样品需求量大的长期研究；体内表达主要指采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架，可以进行较长期研究，但只适用于细胞水平。虾蟹动物作为一种重要的经济甲壳动物，其功能基因的发掘和应用研究进展较慢，主要原因之一是缺乏可用于长期动物实验研究所需的、具有高效基因沉默效果的RNA干扰样品。目前，常用的小干扰RNA在动物实验时难以维持长效的干扰效率，而且动物实验所需RNA用量大，合成成本过高。因此，在探索虾蟹动物基因功能领域中，快速而高效地制备大量的双链RNA样品，是开展长期动物实验研究的重要前提和基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的核糖核酸分子及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，包含有：1)核苷酸序列为SEQIDNO:1的核酸分子Tgtttgctggttttgatgaaaaaaggaatcgtcattcttgagatctggagagcgagattagcaacagaggtcactgcgaataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtctctgaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacgaatgaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcgactctggaacctattccacaggatacggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaattcgctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagctgctgtgcttcagtaatggcgaccacagggtccaatcaggagaatgacccagattcacagtttggacatgatagcggataagaaatatggtactgatttgttaaaaagcatagaatgagctgaattcaatttaaagaaaggattttactacttttactaataagtaaagcgcctgtttctcgacaataaacatcatcacgataggagttaaagaaacatttatgtaaattaggaaataaatcaattcacttaataaaaaaaaaaaa；2)与1)中的核酸分子具有85％以上同源性，且具有1)中核酸分子作用的核酸。上述2)中的同源性，优选为90％以上；上述核苷酸分子编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO2；MAPFFKLISVMVMVAMGFILVSEAASDLQDAAMHDYPTVLEIIGSPRMKRSPHKAESGFYGSNRGMEADFFGDSGTYSTGYGLGGLSRLTGKFSGEGEFAGGAHSGRFYD.为了提高RNAi的效率，申请人对序列为SEQIDNO:1的核酸分子进行了优化选择，在不改变编码蛋白序列的情况下，主要选取目的基因开放阅读框区域，包含338个核苷酸组成的基因片段序列，改造后的核酸分子的序列为SEQIDNO:3；ataatggctcccttcttcaagttgatctccgtcatggtgatggtcgccatgggattcatcctggtctctgaagctgcaagtgatttacaagatgctgcaatgcacgattatccaactgtgcttgaaataatcggaagtccacgaatgaagaggtctccccacaaagcagagagcggtttctacggcagtaacagggggatggaagcagacttctttggcgactctggaacctattccacaggatacggtttggggggtctgtcaagattaacaggcaaattcagtggcgaaggggaattcgctggcggagctcattcaggacgtttttatgattgagc上述的核苷酸分子用于制成双链RNA样品，可实现高效干扰效率，从而干扰罗氏沼虾雄性生殖发育；本专利技术还提供把上述核苷酸分子制成双链RNA的方法，包括有如下的步骤：1)目的核酸片段的扩增：以罗氏沼虾雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因的核苷酸片段，其中扩增所用的引物序列如下：正向引物(ForwardPrimer，FR)序列为：5‘-GCTCTAGAATAATGGCTCCCTTCTTCAA-3’，下划线标注核苷酸为XbaI限制性核酸内切酶的识别位点；反向引物(ReversePrimer，RP)序列为5‘-CGGGATCCGCTCAATCATAAAAACGTCC-3’，下划线标注核苷酸为BamHI限制性核酸内切酶的识别位点；扩增得到目的基因的核苷酸片段两端分别含有限制性核苷酸内切酶的识别位点；2)连接转化利用限制性核酸内切酶，对目的核苷酸片段和双链表达质粒分别进行双酶切。将酶切后的目的片段和质粒进行连接，制备获得含有目的核苷酸片段的重组质粒。将该重组质粒转入到大肠杆菌的感受态细胞E.coliDH5α中，鉴定并挑选出含有正确插入序列的单菌落，-80度保存菌种。3)双链RNA的诱导表达从大肠杆菌中抽提出含有目的插入序列的载体，并将其转入到表达型大肠杆菌的菌株E.coliHT115中，摇菌，进行扩大培养，添加适量的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导双链表达。利用离心的方式收集菌体，根据双链RNA的纯化流程，将菌种中的双链RNA抽提纯化，琼脂糖电泳，测定双链RNA浓度，低温保存待用。通过上述方法，可以简单快捷地将目的核苷酸分子制成双链RNA样品。双链RNA的产率高，可实现每升菌液中微克级双链RNA的提纯，满足动物实验对双链样品浓度需要。同时，利用上述核苷酸分子制成双链RNA样品，可实现高效干扰效率，从而干扰罗氏沼虾雄性生殖发育，动物实验包括如下步骤：1)RNA干扰效率检测将目的基因的双链RNA样品，注射到成熟雄性罗氏沼虾体内开展RNA干扰实验。对照组选用注射等量的绿色荧光蛋白(GFP)双链RNA的雄性沼虾为参照。经过一定时间的养殖实验后，从沼虾的头胸部解剖取出雄性生殖系统各组织，用于干扰效率测定。利用半定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于干扰罗氏沼虾雄性生殖的双链核糖核酸分子，包含有：1)、核苷酸序列为SEQ ID NO:1的核酸分子；2)、与1)中的核酸分子具有85％以上同源性，且具有1)中核酸分子作用的核酸。

【技术特征摘要】
1.核酸分子在制备干扰罗氏沼虾雄性生殖发育的双链RNA中的应用，其中核酸分子的核苷酸序列为SEQIDNO:1。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的核酸分子的核苷酸序列为SEQIDNO:3。3.一种将核苷酸分子制成双链RNA的方法，其特征在于，所述的核苷酸分子的序列为SEQIDNO:1；所述的方法包括有如下的步骤：1)目的核酸片段的扩增：以罗氏沼虾雄性生殖系统组织的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到目的基因的核苷酸片段，其中扩增所用的引物序列如下：正向引物序列为：5′-GCTCTAGAATAATGGCTCCCTTCTTCAA-3′，反向引物序列为5′-CGGGATCCGCTCAA...

【专利技术属性】
技术研发人员：马文明，曹荣荣，杨蓉，钱国英，李东瑞，杨劲树，杨帆，杨卫军，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33