转基因微藻和其用于口服递送蛋白质的用途制造技术

本发明专利技术提供了表达至少一种外源生物活性蛋白质的转基因微藻。该蛋白质表达微藻(protein-expressing microalgae)被用于向靶生物体口服递送呈其完整的和有功能的形式的生物活性蛋白质。在藻类中表达的外源蛋白质的特征在于是生物活性的、发挥至少一种对摄入该藻类的受试者具有有益作用的特定活性。特别地，转基因微藻被用作用于水生或陆生动物保健的动物食物或用作用于人类健康的食物补充剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转基因微藻和其用于口服递送蛋白质的用途专利
本专利技术涉及表达外源生物活性蛋白质的转基因微藻和其用于向动物和人类口服递送生物活性蛋白质的用途。专利技术背景生物活性蛋白质对于活生物体的细胞功能是必不可少的，并且负责包括代谢过程的催化、通信、防御、移动和运输的大多数细胞活性。生物活性蛋白质的口服递送典型是用于两个主要目的所需的：治疗性蛋白质的递送和对动物包括人类具有营养的或另一种有益作用的蛋白质的递送。随着世界范围内对食物特别地对动物蛋白质增加的需求，加之意识到动物生长的环境影响，需要开发将改进陆生(terrestrial)和水生农场动物(aquaticfarmanimals)的繁殖和体重增加的精细化农业管理工具。用于海洋动物包括鱼、甲壳纲动物(crustaceans)和软体动物(mollusks)的生长的水产养殖的发展尤其重要，因为海洋动物被认为是更健康的蛋白质来源。然而，水产养殖对于生长海洋动物且特别是鱼仍然不是完全有效的系统。典型地，鱼需要相对长的时间周期以达到可接受的尺寸和重量。此外，许多品种的鱼以无效的方式成熟，使得问题可在鱼群中发生，导致由于过度缓慢生长、差的形态(对于观赏鱼)等造成的部分群体的损失。此外，在人工水产养殖环境中，水生动物对传染病更为敏感，并且当疾病确实发生时，疾病可以以高的致死率快速传遍整个群体。因此对向陆生和水生农场动物施用治疗性或营养性蛋白质的途径存在需求，所述途径是不昂贵的且不需要费力。向人类口服递送治疗性或营养性蛋白质也是高度可期望的，因为这种施用模式不需要专业人力并且显著提高患者对处方剂量的依从性。蛋白质的生物活性取决于它的序列和/或构象，该构象在蛋白质到达它的活性靶之前必须被维持。对于成功的口服递送，蛋白质应该被保护免受化学和酶促降解，这种降解可发生在将蛋白质加工成食物或饲料组合物的过程和通过经由动物胃肠道的递送过程。除此之外，蛋白质应该克服阻止进入动物或接近靶目的地的结构障碍。微藻类(单细胞藻类或浮游植物)代表地球上最大的、但是最缺乏了解的微生物界。如同植物对于陆生动物，微藻代表水生食物链中所有植物营养素的天然营养基础和主要来源。已经报道了藻类中重组蛋白质的表达，并且多种方法可用于在藻类细胞中尤其是在细胞质体中产生外源蛋白质。国际(PCT)申请公布号WO2011/063284公开了在光合生物体包括原核生物如蓝藻细菌和真核生物如藻类和植物中表达治疗性蛋白质的方法。真核生物转化优选地进入质体基因组，典型地进入叶绿体基因组。此申请公开了藻类细胞中特定治疗性蛋白质的表达。已经做出多种尝试以使用微藻作为用于蛋白质的递送工具。例如，国际(PCT)申请公布号WO01/98335公开了用于向宿主动物递送生物活性蛋白质的递送系统和方法。提供的系统和方法包括获得被表达载体转化的藻类细胞，所述表达载体包括可操作地连接到启动子的编码生物活性蛋白质的核苷酸序列。在一个阐述的实施方案中，生物活性蛋白质是抗原表位并且向动物施用后藻类细胞诱导宿主动物体内的免疫应答。国际(PCT)申请公布号WO2002/076391公开了微生物细胞的用途，该微生物细胞用作水产养殖和农业中的饲料成分，并且该微生物细胞还包括外源肽、蛋白质、和/或抗体，其将传递对病毒或细菌病原体的耐受性或免疫力或以其他方式改善摄入所述微生物细胞的物种的健康和表现。微生物细胞可以是酵母、真菌、细菌或藻类。蛋白质和/或抗体可通过微生物自身的直接遗传修饰或通过使用已被改变以表达感兴趣蛋白质的病毒感染微生物，在微生物细胞内表达。国际(PCT)申请公布号WO2008/027235公开了用于水生动物中疾病或紊乱的预防、改善或治疗的方法，该方法通过使用遗传修饰的微藻直接地或间接地饲养水生动物，该微藻表达特异性靶向感染水生动物的病原体的一种或更多种关键表位的重组分子。美国专利申请公布号2011/0014708公开了在藻类中生产外来的期望的基因产物的方法和包含转基因藻类或它的后代的饲料组合物，该方法包括使用蛋白质酶溶液弱化或移除藻类细胞壁以促进基因转化。本专利技术还提供了用于在藻类中表达牛乳铁蛋白(LFB)的修饰的核酸。然而，对易于生产和使用、维持蛋白质的生物活性并且改善生物活性蛋白质的全身吸收的口服递送系统仍然有未满足的需求并且具有所述口服递送系统将是高度有益的。专利技术概述本专利技术提供了用于向生物体口服递送生物活性蛋白质的基于藻类的平台，提供呈其活性形式的生物活性蛋白质的全身性吸收。特别地，本专利技术提供了在预定的亚细胞区室中表达至少一种外源蛋白质的转基因微藻。蛋白质表达微藻(protein-expressingmicroalgae)被用作适用于饲养水生动物和陆生动物的动物食物或食物添加剂以及适用于人类的食物补充剂。外源蛋白质的特征在于是生物活性的、发挥至少一种对靶生物体具有有益作用的特定活性。本专利技术部分地基于以下的意外发现：当藻类被水生动物(包括鱼和甲壳纲动物)以及被陆生动物(包括小鼠和家禽)口服摄入时，表达的蛋白质保持活性并且发挥其具有有益作用的特定活性。典型地，蛋白质保持呈其完整形式。不希望受任何特殊的理论或作用机制约束，保持的蛋白质活性可归因于其位于完整的微藻中，使得微藻细胞作为保护蛋白质免受在动物的胃肠道和/或酸性的胃中的降解的天然包装材料。根据本专利技术的某些典型的实施方案，蛋白质在微藻的亚细胞区室中，尤其是在液泡中表达。因此，根据一方面，本专利技术提供了包括包含编码生物活性外源蛋白质的至少一种可转录的多核苷酸的表达盒的转基因真核微藻，其中生物活性外源蛋白质在微藻细胞的亚细胞区室中表达。蛋白质在其中表达的亚细胞区室取决于微藻的种类、表达的蛋白质的类型和将要饲养的动物种类。根据某些实施方案，亚细胞区室选自由液泡、内质网、高尔基系统、溶酶体和过氧化物酶体组成的组。每一种可能性代表了本专利技术的单独实施方案。根据某些示例性实施方案，外源蛋白质在微藻细胞的液泡中表达。根据这些实施方案，表达盒还包括编码液泡靶向肽(vacuoletargetingpeptide)的多核苷酸。根据一些实施方案，将外源蛋白质靶向液泡中的肽是具有SEQIDNO:4中列出的氨基酸序列的短的液泡前导序列。根据其他实施方案，编码短的液泡前导肽的多核苷酸包括SEQIDNO:18中列出的核酸序列。根据某些其他示例性实施方案，外源蛋白质在微藻细胞的内质网(ER)中表达。根据这些实施方案，表达盒还包括编码ER靶向肽(ERtargetingpeptide)的多核苷酸。根据一些实施方案，将外源蛋白质靶向ER中的肽是具有SEQIDNO:2中列出的氨基酸序列的三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)内质网(Bip)前导序列。根据其他实施方案，编码ER前导肽的多核苷酸包括SEQIDNO:16中列出的核酸序列。根据本专利技术的教导可使用各种微藻种类。根据某些实施方案，根据本专利技术的教导使用的微藻是海洋微藻。根据某些实施方案，微藻选自但不限于由以下组成的组：三角褐指藻；杜氏藻属(Dunaliellaspp.)；微拟球藻属(Nannochloropsisspp.)包括眼点拟微绿球藻(Nannochloropsisoculata)、盐生微拟球藻(Nannochloropsissalina)、海洋富油微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因真核微藻，所述转基因真核微藻包括包含编码生物活性外源蛋白质的至少一种可转录的多核苷酸的表达盒，其中所述生物活性外源蛋白质在所述微藻细胞的亚细胞区室中表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.23 US 61/692,240;2013.03.14 US 61/781,1031.一种转基因真核微藻，所述转基因真核微藻包括包含编码生物活性外源蛋白质的至少一种可转录的多核苷酸的表达盒，其中所述表达盒还包括核酸序列为SEQIDNO:18所示的多核苷酸，所述核酸序列为SEQIDNO:18所示的多核苷酸编码氨基酸序列为SEQIDNO:4所示的功能性液泡靶向肽，并且其中所表达的生物活性外源蛋白质靶向所述转基因真核微藻的细胞的液泡，并且其中所述转基因真核微藻选自由以下组成的组：三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、杜氏藻属(Dunaliellaspp.)、微拟球藻属(Nannochloropsisspp.)、微绿球藻属(Nannochlorisspp.)、四爿藻属(Tetraselmisspp.)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、巴夫藻属(Pavlovaspp.)、透明茧形藻(Amphiprorahyaline)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和富油新绿藻(Neochlorisoleoabundans)。2.如权利要求1所述的转基因真核微藻，其中所述表达盒还包括编码蛋白结构域的多核苷酸，所述蛋白结构域增强所述生物活性外源蛋白质被异种细胞或组织的摄入。3.如权利要求1所述的转基因真核微藻，所述转基因真核微藻是三角褐指藻。4.如权利要求1所述的转基因真核微藻，其中所述生物活性外源蛋白质具有多达150kDa的分子量。5.如权利要求4所述的转基因真核微藻，其中所述生物活性外源蛋白质具有治疗活性。6.如权利要求4所述的转基因真核微藻，其中所述生物活性外源蛋白质是激素。7.如权利要求6所述的转基因真核微藻，其中所述激素选自由生长激素、食欲诱导激素和产卵激素组成的组。8.如权利要求7所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：西瑞·摩什茨科，多伦·艾森施塔特，盖伊·列维，奥芙拉·陈，
申请(专利权)人：特郎萨格以色列有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL