本发明专利技术提供了一种植物组成型过量表达载体、分枝且高产油菜的制备方法，利用水稻的DHHC型锌指蛋白基因OsDHHC1，构建该基因的植物组成型表达载体，并将其转化甘蓝型油菜，通过抗性筛选，RT-PCR鉴定等获得分支数增加的转基因植株。分析发现，转基因植株的产量比野生型明显增加。结果表明：通过遗传转化培育出了一个多分枝且高产的转基因油菜。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种植物组成型过量表达载体、分枝且高产 油菜的制备方法。
技术介绍
油菜（BrassicanapusL.)不但是世界上仅次于大豆的第二大食用油脂植物而 且同时也是植物油和植物蛋白的主要来源之一，占我国油料作物总产量的40%~45%。 油菜不是一个单一的物种，它包括芸薹属中许多种，根据我国栽培的油菜植物形态特征， 遗传亲缘关系，结合农艺性状，栽培利用特点等可分为三大类型：即白菜型油菜（Brassica campestris)、芥菜型油菜（Brassicajuncea)和甘蓝型油菜（BrassicanapusL.)。甘 蓝型油菜（BrassicanapusL.，AACC2n= 38)是由芸薹（AA2n= 20)和甘蓝（Brassica 01ercea，CC2n= 18)通过自然种间杂交后自然加倍进化而来的一个复合种。 DHHC(Asp-His-His-Cys)型锌指结构域是一种富含半胱氨酸高度保守的锌指结构 域，常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元。属于类C2H2型锌指，其序列特征为：C-X2-C-x9-hc-x 2-c-x4-dhhc-x5-c-x4-n-x3-f(c代表半胱氨酸；H代表组氨酸；X代表任意氨基酸）。 目前，对DHHC型锌指结构域的研宄主要集中在酵母和哺乳动物，植物中的DHHC型 锌指蛋白研宄相对较少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种植物组成型过量表达载体、转基因油菜的制备方法， 旨在通过所获得的植物组成型过量表达载体构建一种分支数和产量都增加的油菜新品种。 本专利技术是这样实现的，一种植物组成型过量表达载体，该表达载体由35S启动子 驱动OsDHHCl基因和⑶S基因形成的融合基因，即35S::0sDHHCl-GUS;其中，所述OsDHHCl 基因是水稻中编码DHHC型锌指蛋白的0s02g0819100基因的另外一种剪接方式，其碱基序 列如SEQIDN0 :1所示。 本专利技术进一步提供了上述植物组成型过量表达载体的构建方法，包括以下步骤： (1)以水稻CDNA为模板，通过引物进行PCR扩增；其中，所述引物为：OsDHHCl基因引物-F :5 ' -CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3 '，OsDHHCl基因引物-R: 5' -GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3' ； (2)将步骤（1)中的PCR扩增产物克隆到pUCm-T载体中，经测序鉴定后，用Ncol 和Bglll双酶切pUCm-T载体和pCAMBIA1301载体，分别回收小片段和大片段，然后进行连 接； (3)将步骤⑵得到的连接产物转化大肠杆菌DH5a，经抗生素筛选获得阳性克 隆；提取阳性克隆的质粒，得到植物组成型过量表达载体。优选地，在步骤（3)中，所述转化的方法是农杆菌介导的遗传转化方法。 优选地，在步骤（3)中，所述转化的方法为将所述植物组成型过量表达载体电击 转化农杆菌GV3101，经100yg/ml利福平和50yg/ml卡那霉素筛选获得阳性克隆，再进行 农杆菌介导的遗传转化。 本专利技术进一步提供了一种分枝且高产油菜的制备方法，包括以下步骤： (1)通过上述植物组成型过量表达载体转化甘蓝型油菜植株； (2)通过抗性筛选和RT-PCR鉴定得到获得分枝且高产油菜。 优选地，在步骤（1)中，所述转化采用农杆菌介导的转基因方法。 优选地，所述步骤（2)具体包括： 对T1代幼苗进行潮霉素抗性筛选，获得的抗性幼苗实行单株收种； 对T2代幼苗继续进行潮霉素抗性筛选，获得纯合子转基因株系； 采用RT-PCR方法对获得的纯合子转基因株系进行鉴定，获得目的基因OsDHHCl表 达量明显增加的转基因纯合子株系。 为克服现有技术的缺点和不足，本专利技术提供了一种植物组成型过量表达载体、分 枝且高产油菜的制备方法，利用水稻的DHHC型锌指蛋白基因OsDHHCl，构建该基因的植物 组成型表达载体，并将其转化甘蓝型油菜，通过抗性筛选，RT-PCR鉴定等获得分支数增加的 转基因植株。分析发现，转基因植株的产量比野生型明显增加，即本专利技术通过遗传转化培育 出了一个多分枝且高产的油菜新品种。【附图说明】 图1是本专利技术Ti类质粒pCAMBIA1301载体的T-DNA表达框的结构示意图； 图2是本专利技术含OsDHHCl基因的Ti类质粒pCAMBIA1301载体的T-DNA表达框的 结构示意图；其中，35S:CaMV35S启动子；OsDHHCl:水稻中编码DHHC型锌指蛋白的基因； hygR:潮霉素抗性标记基因；⑶S: 0 -葡萄糖苷酸酶基因；LB和RB:分别为T-DNA的左边界 和右边界；MCS:多克隆位点；Ncol和Bglll:将OsDHHCl基因构建在pCAMBIA1301载体上所 用的酶切位点； 图3是本专利技术中分枝且高产油菜与野生型油菜的形态对比图；A其中，WT为野生 型，335S::0sDHHCl-GUS-l、35S::0sDHHCl-GUS-2 和 35S::0sDHHCl-GUS-3 为转基因油菜 的三个不同株系； 图4是本专利技术中分枝且高产油菜和野生型的分支数比较图；其中，WT为野生型， 335S: :0sDHHCl-GUS-l、35S: :0sDHHCl-GUS-2 和 35S: :0sDHHCl-GUS-3 为转基因油菜； PCAMBIA1301为pCAMBIA1301空载的转基因植株； 图5是本专利技术中分枝且高产油菜与野生型油菜的⑶S组织化学定位检测结果图； 其中，WT为野生型；335S::0sDHHCl-GUS为分枝且高产油菜； 图6是本专利技术中分枝且高产油菜中Hyg基因的检测结果图；Hyg基因是潮霉素筛 选标记基因； 图7是本专利技术中分枝且高产油菜的半定量RT-PCR鉴定结果图； 图8是本专利技术中分枝且高产油菜的OsDHHCl-GUS基因的检测； 图9是本专利技术分枝且高产油菜和野生型的产量比较图；其中，WT为野生型， 35S::0sDHHCl-GUS-l、35S: ::0sDHHCl-GUS-2 和 35S::0sDHHCl-GUS-3 为转基因油菜； PCAMBIA1301为pCAMBIA1301空载的转基因植株。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并 不用于限定本专利技术。 实施例1分枝且高产油菜的制备 1、OsDHHCl基因克隆和35S::0sDHHCl-GUS表达载体的构建 水稻DHHC型锌指蛋白基因OsDHHCl为专利技术人新克隆的基因，是NCBI中 0s02g819100的另外一种剪接方式，其碱基序列如SEQIDN0:1所示。采用primer5软件 设计PCR引物，引物如下所示：OsDHHCl基因引物-F:5' -CATGCATGCCATGGTGCTGGCACATATATCTCTTATGTC-3 '，OsDHHCl基因引物-R : 5' -GGAAGATCTGGAAGATCTGTTGTTTGTGATCTGGAACTCAGTG-3?, 上述两个引物划线部分为引入的Nc本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种植物组成型过量表达载体，其特征在于，该表达载体由35S启动子驱动OsDHHC1基因和GUS基因形成的融合基因，即35S：：OsDHHC1‑GUS；其中，所述OsDHHC1基因是水稻中编码DHHC型锌指蛋白的Os02g0819100基因的另外一种剪接方式，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周波，刘选明，林建中，
申请(专利权)人：周波，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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