本发明专利技术提供了一种副溶血性弧菌的PCR-ELISA检测试剂盒及检测方法。该检测试剂盒包括：分别用生物素和地高辛标记的副溶血性弧菌Hns基因和副溶血性弧菌tdh基因的上游引物和下游引物、链霉亲和素包被的酶标板、抗地高辛抗体以及一种或多种的PCR反应试剂和ELISA试剂。本发明专利技术还公开了利用该试剂盒快速检测食品样品中副溶血性弧菌的检测方法，该检测方法对副溶血性弧菌具有较强的特异性和较高的灵敏度，检测灵敏度可达100CFU/mL。并且操作简单、快速、成本低、可以进行高通量的样品检测等优点，可广泛用于水产品中副溶血性弧菌的快速检测。
【技术实现步骤摘要】
副溶血性弧菌的PCR-ELISA检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法，属于分子生物学检测领域。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp)是一种革兰氏阴性非芽孢菌，由于其只能在含有盐分的环境中生长，也称为嗜盐菌。因此其主要分布于近海海水、海产品及盐渍食品中，并且有时在江河水和鱼虾蟹等淡水产品中也可以检出大量副溶血性弧菌，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌。副溶血性弧菌主要引起以急性腹泻、呕吐和发烧为主要症状的急性肠胃炎和败血症，是夏秋季食物中毒的主要致病菌。我国已将副溶血性弧菌列为动物性水产干制品、腌醉制生食动物性水产品、即食藻类食品、鱼糜制品等水产食品和水产调味品以及食物中毒样品中致病微生物检测的主要检验或监测对象之一。目前，该菌是多数进出口水产品必检的致病菌。我国食源性疾病监测网数据显示，副溶血性弧菌食物中毒高居沿海沿江省份微生物食源性疾病首位。其中江苏省水产品和食品中副溶血性弧菌的平均检出率为47.2％，部分地区在高发季节时的检出率最高曾达78.0％，污染较为严重。食品中副溶血性弧菌污染已成为严重影响食品安全的主要危险因素。在日本，由该菌引起的食物中毒占全国食物中毒例数的20％～30％；欧盟规定副溶血性弧菌不得检出，美国规定其检出量小于1×104CFU/g。为确保食品安全，保护人民身体健康，对副溶血弧菌进行快速、准确、高通量的检测也就显得十分重要。目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，根据2013年我国颁布的副溶血性弧菌的检测方法标准(GB/T4789.7-2013)，需要对可疑菌落进行生化验证试验，检测工作量相对较大且检测结果一般4-5天才能得出，有时达到10～15天，很难满足快速鉴定的需要；尽管国内外对副溶血性弧菌的诊断技术研究已较为广泛和深入，但仍缺乏快速、简便、经济的检测技术。近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，然而由于其反应结果判断时的凝胶电泳易造成污染并要接触到有毒染料而具有局限性。此外荧光定量PCR技术也因其灵敏度高、特异性强而受到广泛应用，其局限性表现在设备的昂贵、成本的增高以及荧光探针的保存时间较短等方面上。并且上述方法若对其进行高通量的检测也就显得较为麻烦，RiboPrinter全自动细菌鉴别系统(BAX系统)和基因芯片检测技术可对其进行高通量的检测，不过前者仪器本身及其所用的耗材和试剂均比较昂贵，而后者在检测过程中的稳定性较差，因此这些方法均不能满足社会对副溶血性弧菌快速、稳定、准确、经济、高通量的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述目前在食品中副溶血性弧菌的检测中存在的问题，提供一种副溶血性弧菌的快速检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒具有对副溶血弧菌的特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速等优点。本专利技术需要解决的技术问题在于：提供两组以副溶血性弧菌hns(GeneBank登录号为AY046075.1)和tdh(GeneBank登录号为BA000032.1)基因为目的基因的PCR扩增技术的特异性引物，为副溶血性弧菌检测试剂盒的高灵敏度和高特异性提供保障。本专利技术需要解决另一技术问题在于：提供一种操作简单、结果准确的副溶血性弧菌的PCR-ELISA检测试剂盒和检测方法。本专利技术的第一技术问题是采用如下技术方案来实现的：一种副溶血性弧菌的PCR-ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：Hns基因的上游引物Hns-F和下游引物Hns-R，其中上游引物Hns-F的序列如SEQIDNo.1，5’端用生物素标记；下游引物Hns-R的序列如SEQIDNo.2，其5’端用地高辛标记；tdh基因的上游引物tdh-F和下游引物tdh-R，其中上游引物tdh-F的序列如SEQIDNo.3，其5’端用生物素标记；下游引物tdh-R的序列如SEQIDNo.4，其5’端用地高辛标记；链霉亲和素包被的酶标板；抗地高辛抗体。进一步地，所述的试剂盒还含有PCR反应试剂中的一种或多种和ELISA试剂中的一种或多种，其中所述的PCR反应试剂包括DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液中的一种或多种，所述的ELISA试剂包括能与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体进行显色反应的ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)显色剂，能终止ABTS与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体发生显色反应的终止液。进一步地，所述的显色剂为ABTS溶液，所述的终止液为草酸溶液。进一步地，本专利技术所述的试剂盒还含有用于PCR反应中的BSA溶液和用于ELISA反应中的CaCl2溶液。其中，BSA溶液在PCR反应体系中的终浓度为0.3～0.5mg/mL，CaCl2溶液用于在ELISA反应的显色反应阶段，可以提高过氧化物酶标记的抗地高辛抗体中过氧化物酶的活性，其在显色反应体系中的终浓度为2.22mg/mL。本专利技术的第二技术问题是采用如下技术方案来实现的：一种副溶血性弧菌的检测方法，是采用权利要求1所述的试剂盒进行检测，检测方法包括如下步骤：(1)采用常规基因组DNA提取试剂盒提取样品中的基因组DNA，纯化，得模板DNA；(2)以模板DNA为模板，以5’端用生物素标记的上游引物Hns-F和5’端用地高辛标记的下游引物Hns-R为引物，进行PCR扩增反应，得hns基因PCR扩增产物；模板DNA为模板，以5’端用生物素标记的上游引物tdh-F和5’端用地高辛标记的下游引物tdh-R为引物，进行PCR扩增反应，得tdh基因PCR扩增产物；(3)向链霉亲和素包被的酶标板中分别加入以1:20的比例稀释的hns基因PCR扩增产物和tdh基因PCR扩增产物，在37℃下温育、洗涤；用抗地高辛抗体标记，洗涤；用显色剂进行显色反应后检测405nm下的吸光值。在上述检测方法中，根据405nm下的吸光值的评价方法为：OD405值大于0.175，可判定样品为副溶血性弧菌阳性，相反小于0.175则为阴性结果；其中只要hns基因的检测结果为阳性即可判定该样品中含有副溶血性弧菌，为阳性样品；若tdh显阳性，可进一步判定污染的副溶血性弧菌含有tdh基因，具有高致病性。进一步地，在上述检测方法中，在步骤(1)所述的纯化是指，用常规基因组DNA提取试剂盒提取得到的DNA，采用苯酚-氯仿法进一步纯化。该步骤可以除去DNA中抑制PCR扩增的蛋白质和一些酶类，提高目的基因的PCR扩增效率和准确性。进一步地，在上述检测方法中，在步骤(2)所述的PCR扩增反应的反应体系中加入BSA溶液，BSA在反应体系中的终浓度为0.3～0.5mg/mL，优选为0.3mg/mL。进一步地，在上述检测方法中，在步骤(3)所述的显色反应的方法为：向酶标板孔中加入显色剂，并加入CaCl2溶液于37℃恒温箱中反应10min，CaCl2的终浓度为2.22mg/mL。本专利技术的上述所有技术方案中，所述的抗地高辛抗体、显色剂以及终止液可以采用市售的可以实现本专利技术技术方案的试剂，而抗地高辛抗体优选采用浓度为0.15U/mL的Antidigoxigenin-detectingantibodyFabfragments(德国，Roche)；所述显色剂优选采用500mM的草酸溶液；显色剂优选采用ABT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种副溶血性弧菌的PCR‑ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：Hns基因的上游引物Hns‑F和下游引物Hns‑R，其中上游引物Hns‑F的序列如SEQ ID No.1，其5’端用生物素标记；下游引物Hns‑R的序列如SEQ ID No.2，其5’端用地高辛标记；tdh基因的上游引物tdh‑F和下游引物tdh‑R，其中上游引物tdh‑F的序列如SEQ ID No.3，其5’端用生物素标记；下游引物tdh‑R的序列如SEQ ID No.4，其5’端用地高辛标记；链霉亲和素包被的酶标板；抗地高辛抗体。
【技术特征摘要】
1.一种副溶血性弧菌的PCR-ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：Hns基因的上游引物Hns-F和下游引物Hns-R，其中上游引物Hns-F的序列如SEQIDNo.1，其5’端用生物素标记；下游引物Hns-R的序列如SEQIDNo.2，其5’端用地高辛标记；tdh基因的上游引物tdh-F和下游引物tdh-R，其中上游引物tdh-F的序列如SEQIDNo.3，其5’端用生物素标记；下游引物tdh-R的序列如SEQIDNo.4，其5’端用地高辛标记；链霉亲和素包被的酶标板；抗地高辛抗体；PCR反应试剂中的一种或多种和ELISA试剂中的一种或多种，其中所述的PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液中的一种或多种，所述的ELISA试剂包括能与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体进行显色反应的ABTS显色剂，能终止ABTS与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体显色反应的终止液；用于PCR反应中的BSA溶液和用于ELISA反应中的CaCl2溶液；BSA溶液在PCR反应体系中的终浓度为0.3～0.5mg/mL，CaCl2在显色反应体系中的终浓度为2.22mg/mL。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶为ExTaqDNA聚合酶，所述的显色剂为ABTS溶液，所述的终止液为草酸溶液。3.一种非诊断目的的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于，采用...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯红漫，朱耀磊，张公亮，孙黎明，李晓洋，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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