本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂及其制备方法与用途，设计合成了一套特异性的引物及Taqman探针和阳性对照，并利用该引物及探针建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的荧光定量PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地检出非洲猪瘟病毒CP204L基因，可用于来自家猪、野猪和软蜱的各种样本中微量非洲猪瘟病毒CP204L基因的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检 测试剂及其制备方法与用途。
技术介绍
非洲猪瘟病毒是一种有囊膜的单分子线状双链DNA病毒，基因组长约170kb~ 193kb，含有151个~1650RF，其中的CP204L基因编码合成一种大小为30KDa的P30蛋 白，该蛋白不仅是非洲猪瘟病毒感染宿主细胞早期在胞浆内高效表达的特有蛋白之一， 同时也是非洲猪瘟病毒刺激感染动物产生中和抗体抗原性最强的结构蛋白之一（Afonso C. L. , A1 caraz C., Brun A. , Sussman M. D., Onisk D. V. , Escribano J. M. , Rock D. L. Chara cterization of p30,a highly antigenic membrane and secreted protein of Afri can swine fever virus.Virology. 1992 ； 189:368 - 373, Gomez-Puertas P.,Rodrigu ez F. , Oviedo J. M. , Brun A. , Alonso C. , Escribano J. M. The African swine fev er virus proteins p54and p30are involved in two distinct steps of virus at tachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune resp onse. Virology. 1998 ;243:461 - 471)。非洲猪瘟病毒是猪的一种急性、高度接触性传染病一一 非洲猪瘟的病原体，非洲猪瘟病毒感染猪后侵入血流并吸附于血细胞上而迅速散播至全 身，猪血液中的非洲猪瘟病毒在5°C保存时，存活18个月，也可在腐败的血清和分泌物中 长期保存，在冰冻肉尸内可以存活15周，骨髓中达6个月，这些样本都是非洲猪瘟重要 的传播媒介。此外，非洲猪瘟病毒还具有多种自然宿主，包括家猪、野猪和软蜱，在家猪与 野猪之间、野猪与软蜱之间以及家猪与软蜱之间存在复杂的感染循环方式（Penrith，M. L. , Vosloo, ff. , 2009. Review of African swine fever:transmiss ion, spread and control. J. S. Afr. Vet. Assoc. 80, 58 - 62.)对这些宿主及污染物中非洲猪瘟病毒CP204L 基因的检测，可为非洲猪瘟的监测、诊断与防控提供病原学依据。目前，已建立的非洲猪 瘟病毒检测方法包括病毒分离鉴定、病毒抗原检测方法和病毒核酸检测方法（0IE，2008. Chapter 2.8.1. African swine fever. In:Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2008. Office Inter-na tional des Epizooties, Pari France, http://www. oie. int/eng/normes/mmanual/2008/pdf/2. 08. 01ASF. pdf.)，非洲猪 瘟病毒的分离鉴定试验周期长，不适合快速检测。采用荧光抗体试验和抗原捕获ELISA试 验检测非洲猪瘟病毒抗原，具备快速、准确的特点，但对低病毒载量样本缺乏足够的敏感性 低，易出现假阴性结果。荧光PCR技术将PCR与荧光检测结合起来，克服了传统PCR费时、 易污染和扩增后需电泳检测等缺点，已在非洲猪瘟病毒核酸检测方面得到应用，目前已报 道的荧光PCR方法所采用的引物和标记探针主要是针对非洲猪瘟病毒VP72、P54和K205R 基因序列设计制备的（KING D. P.，RE ID S. M.，HUTCHINGS G. H.，GRIERSON S. S.，WILKINSON P. J. , DIXON L. K. , BASTOS A. D. S. &DREW T. ff. (2003). Development of a TaqMan? PCR assay with internal amplification control for the detection of African swine fever virus. J. Virol. Methods，107, 53 - 61.)，而基于非洲猪瘟病毒CP204L基因基因研制 的荧光PCR检测试剂及应用还未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检 测试剂及其制备方法与途，具体涉及一种以非洲猪瘟病毒CP204L基因为扩增靶序列而研 制的检测试剂，该检测试剂包括一对引物、一条标记探针和一个阳性对照。 为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是通过以下步骤实现的：一种非 洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一 个阳性对照，扩增目标长度为79bp，引物和探针序列为： 上游引物：CP204L-F:5' -GCAGGGCAAGGGTATACTGA-3' SEQ ID NO. 1 下游引物：CP204L-R :5' -CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC-3' SEQ ID NO. 2 探针：CP204L-P:5' -FAM-CCATTCTTCTTGAGCCTG-3' -MGB SEQ ID NO. 3 阳性对照：CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAAC ATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC SEQ ID NO. 4。 上述的非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂的制备方法，其特征在于， 包括以下步骤： (1)选择非洲猪瘟病毒CP204L基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目 标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，为： CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTC AAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC ； (2)设计4条引物，以之PCR扩增和制备CP204L基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO. 5-SEQ ID NO. 8 如下： CP204LF1:5 ' -ATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGCTCAAGAAGAATGGAATATGAT TC-3' CP204LR1 :5' -GAATCATATTCCATTCTTCTTGAGCCTGATGTTCAGTATACCCTTGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种非洲猪瘟病毒CP204L基因的荧光PCR检测试剂，其特征在于，包含一对特异性引物、一条特异性探针和一个阳性对照，扩增目标长度为79bp，引物和探针序列为：上游引物：CP204L‑F:5’‑GCAGGGCAAGGGTATACTGA‑3’ SEQ ID NO.1下游引物：CP204L‑R：5’‑CTGTCTCCTCTTCAAACAGCAC‑3’ SEQ ID NO.2探针：CP204L‑P:5’‑FAM‑CCATTCTTCTTGAGCCTG‑3’‑MGB SEQ ID NO.3阳性对照：CTGTTAAGTATGATATTGTGAAATCTGCTCATATATATGCAGGGCAAGGGTATACTGAACATCAGGC TCAAGAAGAATGGAATATGATTCTGCATGTGCTGTTTGAAGAGGAGACAGAATCCTC SEQ ID NO.4。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，赵祥平，张俊哲，王玉玲，董志珍，肖妍，赵丹，陈本龙，陈小金，王乃福，
申请(专利权)人：天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：天津;12
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