一种香榧芽体内源激素的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种香榧芽体内源激素的检测方法，将香榧花芽用提取液浸提后过固相萃取柱，浓缩，在96孔酶标板中分别加入标准物、待测样和加有抗体的稀释液，每孔50μl，洗版4次，将加入酶标二抗的稀释液中加入酶标板，每孔加100μl，在湿盒内，37℃下，温育0.5h，洗板，称取邻苯二胺溶于底物缓冲液中溶解，并添加30％H202，在每孔中加100μl，放入湿盒内，显色适当后每孔加入50μl2mol/L硫酸终止反应，测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值，计算结果。本发明专利技术方法操作简单，准确度高，回收率高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，在植物激素测定方面具有推广使用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物激素提取
，具体设及一种香栖芽体内源激素的检测方 法。
技术介绍
植物激素是植物体内普遍存在的一系列微量有机化合物，它的主要功能是调节植 物生长发育，主要包括生长素（IAA)、赤霉素（GA3)、细胞分裂素（CTK)、脱落酸（ABA)和己 締巧th)五大类，目前又发现寡糖素和油菜固醇内醋等化合物。该些植物激素与植物生长 发育和代谢过程的调节控制密切相关，对生命活动、遗传育种、栽培及贬藏保鲜领域的研究 具有重要的意义。要深入了解植物激素与植物生长发育的关系，必须检测激素在植物体内 的分布及含量的变化。但激素含量甚微，通常为纳克级，研究人员对其分析测定经历了生物 测定法、免疫分析法、物理化学分析法等阶段。早期的激素鉴定几乎全靠生物测定，因其灵 敏性及专一性均不够高，已较少使用。 免疫分析技术和高效液相色谱（HPLC)自20世纪70年代W来广泛应用在植物激 素的检测中，植物激素的提取、纯化和分析方法。其中，高效液相色谱法0PLC) -直W来受 到国内外学者的推崇，是已广泛应用于除己締外激素的测定。高效液相色谱法灵敏度高、专 一性强和重复性好，是较理想的植物内源激素分析方法，目前已被广泛应用于植物内源激 素的测定。但是，HPLC法在实际运用中，受多种因素限制，而且，在对于微量的激素和某些 物种，检测起来仍然有难度。香栖（Torreya grandisCV. Merrillii)是红豆杉科（Taxaceae)栖树属 (Torreya)栖树种（Torreya grandis. F'oi't. ex Lindl)中的自然变异类型经人工培育发展 而成的优良品种，是我国特有的集果用、材用、药用、油用及生态观赏于一体的珍贵经济树 种。香栖是裸子植物，切片分析表明，其花芽分化的时间分别是头年10月至次年4月。研 究阐明香栖花芽分化的机理，并由此研究开发能促进香栖早成花的新技术将具有重要现实 意义。香栖的花芽分化过程也受控于各类内源激素的相互作用，研究不同激素在花芽分化 期的变化规律，探讨有效激素的平衡关系将有助于阐明香栖的花芽分化调控机理及研发调 控技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种准确可靠，可用于常规的香栖植物激素检测的方法， 该方法利用酶联免疫吸附分析法，具有灵敏性、特异性高，且方便、快速、安全、成本低廉的 特点。 本专利技术具体通过W下技术方案实现： 一种香栖芽体内源激素的检测方法，具体包括W下步骤：[000引 1)采集香栖花芽置于提取液中4°C过夜浸提，3500转/min离屯、15min，取上清液； 2)上清液过C-18固相萃取柱，萃取液浓缩，除去甲醇用稀释液定容； 3)在96孔酶标板中分别加入标准物、待测样和加有抗体的稀释液，每孔50 y 1 ; 4)洗版4次，将加入酶标二抗的稀释液中加入酶标板，每孔加100 y 1，在湿盒内， 37°C下，温育0.化，洗板；[001引 W称取邻苯二胺溶于底物缓冲液中溶解，并添加30% &02,在每孔中加100 y 1，放 入湿盒内，显色适当后每孔加入50 y 1 2mol/L硫酸终止反应； 6)在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。 所述的提取液为将二叔了基对甲苯酪的甲醇溶液，其中甲醇的浓度为80%，二叔 了基对甲苯酪的浓度为1mmol/L。 所述的稀释液通过在500ml PBS中加0. 5ml Tween-20和0. 5g明胶后加热制得。 所述的底物缓冲液为通过称取5. lOg CeHs〇7 ?&0,18. 43肖化2册〇4 .IS&O,加1000ml 蒸馈水和1ml Tween-20制得抑为5. 0的溶液。 所述的显色适当为肉眼能看出标准曲线有颜色梯度。 本专利技术的有益效果为：采用酶联免疫方法进行植物激素测定，经多次试验证明，其 方法准确可靠，可用于常规的香栖植物激素检测，相对生物测定和HPLC分析，免疫测定植 物激素优点是操作简单，准确度高，回收率高，且方便、快速、安全、成本低廉的特点，在植物 激素测定方面具有推广使用价值。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术做进一步的说明，W下所述，仅是对本专利技术的较佳实施 例而已，并非对本专利技术做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的
技术实现思路
加W变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本专利技术方案内容，依据本专利技术 的技术实质对W下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本专利技术的保护范围内。 实施例1[002U 本试验中测定的香栖植物激素包括；ABA，ZR，IAA，GA3。具体方法如下； 1.材料；新鲜采集香栖花芽，准确称取0. 5g(精确到Img)，液氮速冻半小时，-70°C 超低温保存。[002引 2.仪器设备 研鉢，冷冻离屯、机，台式快速离屯、浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度 计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10 y 1，40 y 1， 200 y 1，1000 y 1)，带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3.试剂 1)磯酸盐缓冲液（PBS);称取8. Og化C1，0. 2g皿2?〇4, 2. 96径化2册〇4 ? 12&0,用量 筒加1000ml蒸馈水，抑为7. 5。 2)样品稀释液；500ml PBS中加0. 5ml Tween-20,0. 5g明胶（稍加热溶解）。[002引扣底物缓冲液；称取5. lOg C品07 ? &0 (巧樣酸），18. 43肖化2册04 ? 12&0,用量筒 加1000ml蒸馈水，再加1ml Tween-20,抑为5. 0。 4)洗漆液；1000ml PBS 加 lm]_Tween-20。 5)终止液；2mol/L H2SO4。 6)提取液；80%甲醇，内含Immol/L BHT (二叔了基对甲苯酪，分子量220. 36D，为 抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度）。[00对 4.操作步骤 1)样品中激素的提取 a.称取0.5g新鲜植物材料，加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml 试管，再用2ml提取液当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香榧芽体内源激素的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：1)采集香榧花芽置于提取液中4℃过夜浸提，3500转/min离心15min，取上清液；2)上清液过C‑18固相萃取柱，萃取液浓缩，除去甲醇用稀释液定容；3)在96孔酶标板中分别加入标准物、待测样和加有抗体的稀释液，每孔50μl；4)洗版4次，将加入酶标二抗的稀释液中加入酶标板，每孔加100μl，在湿盒内，置37℃下，温育0.5h，洗板；5)称取邻苯二胺溶于底物缓冲液中溶解，并添加30％H202，，在每孔中加100μl，放入湿盒内，显色适当后每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应；6)在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梅丽，吴家胜，黄坚钦，刘颖坤，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33