生物样品的稳定化制造技术

本发明专利技术提供了用于使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定和用于使所包含的细胞的转录组稳定的方法、组合物和装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 产生本专利技术的工作接受了来自于欧盟第七框架计划（European Community's Seventh Framework Programme) (FP7/2007-2013)在拨款协议号 222916 下的资助。
本文公开的技术尤其涉及适合于使含细胞的样品、特别是血液样品稳定的方法和 组合物，并涉及从相应稳定化的生物样品分离核酸的方法。
技术介绍
在诊断学领域中，核酸是重要的生物标志物。例如，基因组的转录本（特别是mRNA 和miRNA)的情况在分子体外诊断学中被广泛用作生物标志物，为正常的生物和病理过程 提供见解，并有望预测疾病结果和指示个体化的治疗过程。因此，核酸、尤其是RNA的情况 分析，在疾病诊断、预后和用于生物标志物发现的临床试验中是重要的。从转录情况获得定 量信息的能力，是探索基础生物学、诊断疾病、促进药物开发、为特定病理和遗传情况定制 疗法以及产生与生物或治疗过程和途径相关的数据库的强有力工具。近年中，已对下游测 定法和数据分析（分析过程）做出显著改进。然而，已发现预分析步骤例如特别是用于新 的生物分子靶的样品操作和样品稳定化，对表达情况具有严重影响，并且可能损害后续分 析（参见例如Hartel等，2001 ;Pahl和Brune，2002)。如果在待分析的样品的稳定化中不 采取预防措施，样品将在运输和储存期间经历可能严重改变被靶向分子的表达情况的变化 (参见例如Rainen等，2002 ;Baechler等，2004)。因此，基因表达、尤其是血液细胞的基因 表达，对样品的离体操作敏感。如果由于样品的操作造成表达情况改变，后续分析不反映出 样品以及因此患者的原始情况，而是测量在样品操作、运输和储存期间产生的人为情况。因 此，需要使表达情况稳定从而允许进行可靠分析的优化的稳定化方法。尤其是，对于使血液 样品稳定以便允许分析血液细胞的基因表达情况，存在着需求。 样品例如尤其是血液样品的较长期稳定化，在正式情况下通过添加有机溶剂例如 苯酚和/或氯仿或通过在液氮中或使用干冰直接冷冻来进行。这些方法对于医院、医生手 术或常规诊断实验室来说是完全不实用的技术。为了克服这些问题，PreAnalytiX开发了 使用含有用于在收集样品的时间点立即使RNA基因表达情况稳定的试剂的真空血液收集 管（PAXgene血液RNA管）来收集人类血液的第一种研宄产品。相应的稳定化组合物允许 在室温下运输和储存而没有由基因诱导和转录本降解引起RNA情况变化的风险（参见例如 US 6,617，170，US 7,270,953，Kruhoffer等，2007)。实现样品、在这里是血液的立即裂解 的其他稳定化试剂，由ABI/Life Technologies在名称Tempus血液RNA管产品下销售。另 一种产品是Biomatrica Vacuette RNAgard血液管。使用这种管时裂解也在收集期间立即 发生，并且RNA酶被失活，正如RNA随着血液温育时间保持完整所示出的。相应的方法的缺 点在于稳定化引起细胞的完全裂解。细胞的破坏导致细胞内核酸变得与细胞外核酸混合， 这阻止了这两种核酸群体的单独分析。此外，不仅分离的核酸的质量和数量以及它们相应 的表达情况在分析上是重要的，而且样品例如血液样品中包含的特定细胞的存在、不存在 或数目，在分析上也是重要的。由于任何细胞分拣或细胞富集以及相应的细胞分析变得不 可能，因此细胞的破坏是极为不利的。 因此，通常提供具体地旨在用于细胞稳定化的特定稳定化试剂和相应的血液收集 管。相应的产品允许调查样品在储存后的细胞含量，以例如通过荧光激活细胞分选（FACS) 分析检测肿瘤细胞的存在，或通过流式细胞术（FC)或FACS分析检测不同白血细胞彼此的 比率。例如，许多工作流程将标准的EDTA血液收集管用于流式细胞术或FACS分析，尽管血 液细胞在储存时间内显示出少量裂解。来自于Streck Inc.的另一种产品是直接抽取式真 空血液收集管，其用于保存全血样品用于通过流式细胞术进行免疫表型分型。其保存了白 细胞抗原，使得白细胞的子集可以通过流式细胞术分析区分开来。维持白细胞分化抗原簇 (CD)标志物的完整性的技术被例如US 5, 460, 797和US 5, 459, 073覆盖。 然而，将不同稳定化试剂和相应的稳定化管用于收集样品以进行核酸分析和细胞 分析是繁琐的。对于减少在患者地点处每次抽血时用于不同下游测定法（例如细胞的检测 和RNA的分析）的不同样品收集管例如血液收集管的数目，存在着需求。因此，需要保护细 胞的形态并在同时使核酸稳定的样品收集和稳定化系统。为应对同时进行细胞稳定化和核酸稳定化的需求，开发了基于甲醛释放剂的使用 的稳定化系统。代表性的稳定化试剂可以从Streck Inc.在商品名无细胞RNA BCT(血液 收集管）下商购。这种l〇ml的血液收集管旨在用于将血浆中的无细胞RNA在室温下保存 并稳定化长达3天。所述防腐剂使血浆中的无细胞RNA稳定，并防止在样品处理和储存期 间非靶的背景RNA从血细胞释放。US 2011/0111410描述了使用释放甲醛的组分在同一血 液样品中实现细胞和RNA的稳定化。因此，这份文件描述了一种技术，在所述技术中稳定化 试剂使抽取的血液中的血细胞稳定，从而防止细胞内RNA被无细胞RNA或球蛋白RNA污染， 将RNA合成抑制至少2小时，并保护血细胞内的细胞内RNA，以保持血细胞的蛋白表达模式 与抽血时相比基本上不变。可以从相应的稳定化的样品分离白细胞，然后从白细胞提取细 胞RNA。然而，由于所使用的甲醛释放剂干扰后续的核酸分离过程，因此从相应的稳定化的 样品分离核酸非常困难。因此，与使用具体来说旨在用于核酸例如RNA的稳定化和分离的 稳定化方法（例如PAXgene血液RNA管）稳定化的核酸的分离相比，核酸得率和/或纯度 严重降低。 此外，在现有技术中已知用于稳定化含细胞的样品例如血液或组织样品的方法， 所述方法使细胞、转录组、基因组和蛋白质组稳定。这样的方法公开在例如W0 2008/145710 中。所述方法是基于特异性稳定化化合物的使用。与包含甲醛释放剂的稳定化方法相反， 核酸的分离不受稳定化试剂的损害。 含细胞的生物样品中存在的另一类临床上重要的核酸物质是细胞外核酸。已在 血液、血浆、血清和其他体液中鉴定到细胞外核酸。在相应样品中发现的细胞外核酸，由 于它们受到保护而免受核酸酶影响（例如因为它们以蛋白脂质复合物的形式分泌、与蛋白 质结合或被包含在囊泡内）这一事实，因此具有一定程度的抗降解性。在许多医学病症、 恶性肿瘤和感染过程中存在水平升高的细胞外核酸例如DNA和/或RNA，对于疾病进展的 筛选、诊断、预后、监测，对于鉴定潜在的治疗靶点以及对于监测治疗反应来说，是尤其重 要的。此外，母体血液中升高的胎儿DNA/RNA被用于确定例如性别鉴定、评估染色体异常 和监测妊娠相关的并发症。因此，细胞外核酸在非侵入性诊断和预后中特别有用，并且可 以在许多应用领域例如非侵入性产前遗传检测、肿瘤学、移植医学或许多其他疾病中用作 例如诊断标志物，并因此具有诊断相关性（例如胎儿来源的核酸或肿瘤来源的核酸）。然 而，在健康人类中也发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过将含细胞的生物样品与至少一种式1的化合物相接触来稳定所述样品的方法其中R1是氢基团或烷基基团，R2和R3是以直链或支链方式排列并具有1‑20个原子的碳链长度的相同或不同的烃基团，R4是氧、硫或硒基团，并且其中所述式1的化合物是N,N‑二烷基丙酰胺。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁·霍利茨，安娜贝尔·舒伯特，马库斯·施普伦格豪塞尔斯，凯利·京特，拉尔夫·怀里希，乌伟·厄尔米勒，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE