一种玉米骨干自交系的高效转基因方法技术

本发明专利技术提供一种玉米骨干自交系的高效转基因方法，该方法通过在共培养基和休息培养基中添加细胞激动素KT(6-糖基氨基嘌呤)0.01-1mg/L，同时在选择培养基中确定最佳的筛选剂浓度，即双丙氨膦添加浓度为0.5-50mg/L，实现了对玉米骨干自交系高效率的转化效果。本发明专利技术方法具有实验周期短、阳性率高、操作简单方便的特点，用于制备转基因玉米，适合大规模推广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域和作物育种领域，具体地说，涉及一种玉米骨干自交系 的高效转基因方法。
技术介绍
转基因玉米是世界上最重要的转基因作物之一。2010年全球转基因玉米种植面积 达4680万公顷，占全球玉米总面积的26%。在玉米转基因技术上，直到80年代后期才在转 化方面取得突破。第一例成功的玉米自交系（A188)培养出再生植株报道于1975年。一直 到1988年，Klein等人用基因枪法把cat基因转移到玉米的胚状体和非胚状体细胞中，并 发现有短暂表达。与此同时，基因表达和标记系统也得到发展。到1996年，农杆菌共培养 法才成功用于转化自交系A188。玉米转化方法除了基因枪法，还包括电击法、超声波法、微 注射法、PEG法和农杆菌介导法。 转基因玉米的研究走过了对转化方法的探索阶段、直接遗传转化方法的研究与发 展阶段，而今已经入商品化阶段。因此，专利技术适合商业化生产的玉米品种的高效稳定的转基 因方法，对于抢占转基因玉米市场先机起着至关重要的作用。 相比综31、Hi-II、A188等这些常用来作为玉米转化的受体材料而言，'祥249'作 为市场推广品种'长城799'的母本材料，属于国内市场推广品种，具有适应国内气候条件、 农艺性状良好的优点。而且建立玉米优良自交系组织培养体系，进而把外源基因直接导入， 可缩短育种周期，加速基因工程产业化的进程。然而在实际操作中，按照常规的转基因方法 制备'祥249'转基因品种存在诸多缺点，主要表现在转化效率低，阳性率低、转化周期长等 方面。因此如何突破玉米骨干自交系'祥249'基因型限制，探索出适合'祥249'胚性愈伤 组织形成及再生的培养基体系，建立一种适合自交系'祥249'的玉米转基因方法，提高转化 效率和阳性率是本领域技术人员迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于工业化规模的向玉米骨干自交系导入外源基因 的的高效转基因方法。 本专利技术提供的玉米骨干自交系转基因方法包括以下步骤： (1)将玉米骨干自交系的幼胚浸入携带外源基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中 侵染； (2)将幼胚移至含有细胞激动素KT的共培养基上培养； (3)将幼胚移至含有细胞激动素KT的休息培养基上培养； (4)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含筛选剂双丙氨膦，诱导胚性愈 伤组织；再转移到分化培养基上，分化形成再生小苗； (5)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。 本专利技术方法适用的导入外源基因不限于实施例所述的基因，包括本领域技术人员 希望导入玉米中的任何外源基因。 本专利技术方法中，步骤（1)中玉米骨干自交系的幼胚是从授粉后6-15天，待玉米幼 胚长至0. 5-2. 0mm时从玉米穗上剥取获得。 其中，步骤（1)的侵染时间不超过15min。所述的农杆菌为EHA105或LBA4404。 其中，步骤（2)中共培养基含KT浓度为0.01-lmg/L。 优选地，共培养基含KT浓度为0. 05-0.lmg/L。更优选地，共培养基含KT浓度为 0?lmg/L〇 其中，上述步骤（2)培养条件为23°C黑暗培养48-96h。 其中，步骤（3)中休息培养基含KT浓度为0? 01-lmg/L。 优选地，休息培养基含KT浓度为0. 05-0.lmg/L。更优选地，休息培养基含KT浓度 为 0?lmg/L。 其中，上述步骤（3)培养条件为26-34°C黑暗培养1-2周。 本专利技术方法的步骤（4)中选择培养基中双丙氨膦的浓度为0. 5-50mg/L。优选地， 选择培养基中双丙氨膦的浓度为3-10mg/L。 更优选地，选择培养基中双丙氨膦的浓度为8mg/L。 优选地，本专利技术方法中所述的玉米骨干自交系为'祥249'。 本专利技术还提供了细胞激动素KT(6_糖基氨基嘌呤）在制备转基因植物中的应用。 细胞激动素KT在作物育种中的应用也属于本专利技术的保护范围。 进一步，上述细胞激动素KT在制备转基因植物中的应用表现在，在植物胚性愈伤 组织形成及再生的培养基体系中添加KT。 具体地，在共培养基上和休息培养基上，KT的浓度为0. 05-0.lmg/L。 本专利技术方法具有操作简单方便、实验周期短的特点，利用本专利技术的转基因方法在 55-70天就能得到转化植株，而常规玉米转化周期一般为3个月，本专利技术方法大大缩短了转 基因玉米的培养周期，提高了转化效率。另外本专利技术方法获得的转化植株阳性率高，适合转 基因玉米的大规模推广使用。【附图说明】 图1为外源基因（GFP)在组织中的表达图。图1A为外源基因（GFP)在转化玉米 幼胚的表达图；图1B为外源基因（GFP)在转化愈伤组织的表达图；图1C为外源基因（GFP) 在转化植株叶片的表达图。a:阳性植物材料在白光下的影像；b:阳性植物材料在荧光下的 影像；c:阴性植物材料在白光下的影像；d:阴性植物材料在荧光下的影像。 图2为转基因植株中外源基因（Bar)PCR扩增结果图。M:为2KBMarker分子量标 准；1-13:本专利技术制备的转基因玉米编号；N:阴性对照；P:阳性对照。 图3为转基因植株中外源基因SouthernBlot检测图。WT为阴性对照，1、2、3、4、 5、6、7号为转基因玉米检测样品。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神 和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段； 若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。 实施例1含目的基因的根癌农杆菌的制备 本【具体实施方式】使用的农杆菌菌株是EHA105和LBA4404。通过本领域常用的农 杆菌转化方法将抗除草剂基因Bar(基因序列如SEQIDN0 :1)、绿色荧光蛋白编码基因 GFP(基因序列如SEQIDN0 :2)转入农杆菌。需要理解的是，本【具体实施方式】是以绿色荧 光蛋白编码基因作为外源基因的示例，但本专利技术不限于特定的外源基因。本实施方式所用 到的农杆菌导入基因、载体构建方法及所用质粒等只是为本领域技术人员所熟知。 侵染前一周，从_80°C冰箱取20iiL甘油菌，在添加相应抗生素的YEP培养基板 上划线（EHA105 对应抗生素为Kana50mg/L、Rif20mg/L;LBA4404 对应抗生素Kan50mg/L、 Str25mg/L);将划好的菌板放于28°C黑暗培养24小时左右待单克隆菌落长出，取出放于 4°C冰箱备用。储存时间不宜超过一周；用一次性接种环从单克当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米骨干自交系的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将玉米骨干自交系的幼胚浸入携带外源基因和Bar标记基因的农杆菌菌液中侵染；(2)将幼胚移至含有细胞激动素KT的共培养基上培养；(3)将幼胚移至含有细胞激动素KT的休息培养基上培养；(4)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含筛选剂双丙氨膦，诱导胚性愈伤组织；再转移到分化培养基上，分化形成再生小苗；(5)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：许洁婷，佘秋明，周倩，文琴，黄磊，胡燕琳，卢涛，章旺根，
申请(专利权)人：中国种子集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11