本发明专利技术公开了一种乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因序列如SEQ ID No.2所示；该融合蛋白携带有三种乙肝病毒抗原的四个超型表位，分别为HBsAg281-290、HBcAg98-107、Pol321-330和Pol661-670，还携带有Th表位Padre和志贺毒素，融合蛋白可用于制备乙肝治疗性疫苗，具有靶向性强、适应人群广等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种融合蛋白，还涉及该融合蛋白的制备方法，以 及在制药领域中的应用。
技术介绍
乙肝病毒（HBV)是重要的肝脏疾病致病因子。慢性HBV感染患者主要表现为肝损 伤以及与脂肪变性和纤维化相关的代谢紊乱，长期感染患者有可能发展为肝硬化和肝癌。 目前治疗慢性HBV感染主要采用以抗病毒药物和细胞因子为主、中医药为辅的治疗方法， 虽然取得了一定疗效，但存在不能有效清除HBV、复发率高等缺点。因此，研宄慢性HBV感染 的新型治疗方法和治疗药物是我国当前亟待解决的重大课题之一。 随着乙肝病毒学和现代免疫学的快速发展，细胞毒性T淋巴细胞（CTL)在HBV清 除过程中的关键作用得到深刻认识。利用CTL抑制HBV的复制并进一步将其清除，已成为 极富前景的慢性HBV感染治疗方法。现有文献已报道了一些以激发特异性CTL反应为目 标的乙肝疫苗，包括多肽疫苗、蛋白疫苗和DNA疫苗等。但这些疫苗并不完善，例如多肽疫 苗多数是由单一抗原单一 MHC限制性的单一表位或多表位串联而成，存在表位单一、宿主 限制性、免疫原性差等缺点；蛋白疫苗可以多次免疫，但由于单一蛋白抗原表位的免疫原性 差，在体内不能有效激发特异性CTL反应；DNA疫苗虽然在体内可以有效激发特异性CTL反 应，但由于质粒DNA的转染具有非特异性，对体细胞的转染可导致T细胞对该抗原耐受，存 在多次免疫效果差的问题，难以适应慢性HBV感染患者长期治疗、多次免疫的要求。因此， 迫切需要开发一种适应广泛人群MHC限制性的更高效的乙肝疫苗。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白，免疫原性和靶向性强，能够激发 特异性CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒，同时能够适应广泛人群MHC限制性，可用于制 备高效乙肝疫苗。 为达到上述目的，经研宄，本专利技术提供如下技术方案： 1.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。 2.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。 3.含有上述编码基因的重组表达载体。 4.含有上述重组表达载体的转化菌。 5.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：将核苷酸 序列如SEQ ID No. 2所示的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因克隆入质粒 PET300中，获得重组表达载体pET300-STXB-EP ;将重组表达载体pET300-STXB-EP转化大肠 杆菌BL21 (DE3)，用终浓度为lmmol/L的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷于温度37°C诱导 表达4小时，收集菌体，超声破碎，离心取上清，用Ni2+亲和层析柱纯化，用TEV蛋白酶酶切 去除His标签，再过葡聚糖凝胶G75分子筛纯化，即得乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋 白。 6.乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白在制备乙肝治疗性疫苗中的应用。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了一种乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合 蛋白，其携带有三种乙肝病毒抗原的四个超型表位，分别为HBsAg281-290、HBcAg98-107、 P〇1321-330和P〇1661-670,还携带有Th表位Padre和志贺毒素，其中，四个超型表位免疫 原性和靶向性强，能够有效激发广谱、特异的CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒，而且四 个超型表位的MHC限制性包括A2、A3两大超型，可以覆盖90%以上的中国人群；Th表位 Padre能够有效辅助特异性CTL的产生；志贺毒素在体内靶向树突状细胞，可使融合蛋白易 于被树突状细胞捕获，进而呈递给T细胞，激活CTL反应；该融合蛋白可用于制备乙肝治疗 性疫苗，具有靶向性强、适应人群广等优点。【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行 说明： 图1为乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的编码基因 PCR扩增产物的琼脂糖 凝胶电泳图，其中泳道1为DNA分子量标准，泳道2为PCR扩增产物。 图2为重组质粒pET300-STXB-EP酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为 DNA分子量标准，泳道2和3为NcoI酶切产物，泳道4和5为NcoI和XbaI双酶切产物。 图3为pET300-STXB-EP转化菌表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为蛋白质 分子量标准，泳道2为未经IPTG诱导的表达产物，泳道3和4为经IPTG诱导的表达产物， 泳道5为纯化的携带His标签的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白。 图4为经酶切并过Sephadex_G75分子筛后的蛋白电泳图，其中泳道1为蛋白质分 子量标准，泳道2为携带His标签标签的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，泳道3和 4为经酶切并过S印hadex-G75分子筛后的蛋白即纯化的乙肝病毒多表位与志贺毒素的融 合蛋白。 图5为HBV多表位融合志贺毒素蛋白分别免疫HLA-A*0201和HLA-A*1101转基因 小鼠前后HBV DNA和HBcAg的变化。 图6为HBV多表位融合志贺毒素蛋白靶向树突状细胞流式结果。峰1为对照HBV 多表位融合多肽，峰2为HBV多表位融合志贺毒素蛋白。【具体实施方式】 以下将参照附图，对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的设计与制备 -、乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白的设计 首先，选取体外诱导特异性CTL分泌细胞因子IFN-γ的能力高于对照表位 HBcAgl8-27 的 4 个乙肝病毒超型表位：HBsAg281-290、HBcAg98-107、P〇1321-330 和 P〇1661-670,以有效激发广谱、特异的CTL反应，高效抑制和清除乙肝病毒； HBsAg281-290 :氨基酸序列为CPLLPGTSTT，MHC限制性为A3超型（包括A0301、 A1101)； HBcAg98-107 :氨基酸序列为RQLLWFHISC，MHC限制性为A2超型（包括A0201、 A0206、A0207 和 A0209); P〇1321-330:氨基酸序列为LSCWWLQFRN，MHC限制性为A3超型（包括A0301、 A1101、A3202、A3302 和 A5001); P〇1661-670 :氨基酸序列为 IQAKQAFTFS，MHC 限制性为 A2 超型（包括 A0201、A0202 和 A0203)。 其次，选取通用Th表位Padre (氨基酸序列为AKFVAAWTLKAAA)以有效辅助特异性 CTL的产生。 再次，设计各表位的连接方式及连接肽如下：GAA- (HBsAg281-290) -GAAA- (HBcAg9 8-107) -KAA- (Padre) -GAAA- (P〇1321-330) -NAAA- (P〇1661-670) -GAA，获得乙肝病毒多表位 融合肽。上述表位连接方式的优点在于，可以实现不同抗原表位和不同表位限制性的交叉， 能更有效地激发特异性CTL本文档来自技高网...
【技术保护点】
乙肝病毒多表位与志贺毒素的融合蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘东，刘威，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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