本发明专利技术公开了转基因苜蓿草J101品系特异性环介导等温扩增检测用引物及检测方法和应用。所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示。本发明专利技术针对我国农业部未颁发农业转基因生物安全证书的美国孟山都公司转基因苜蓿草品系J101，首次提供了一组特异性引物，以BstDNA聚合酶启动环介导等温扩增。通过对LAMP检测体系的优化，成功建立了苜蓿草J101品系特异性LAMP快速检测体系，操作简单，特异性强，灵敏度高，检测结果准确，检测最低拷贝数为10，能够快速、准确、地对转基因苜蓿草J101成分进行检测分析和鉴定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性环介导等温扩增(LAMP)检测用引物及检测方法和应用。
技术介绍
转基因苜蓿草JlOl品系由孟山都公司开发的耐除草剂的转基因品系，2005年美国和加拿大批准环境释放和作为饲料应用，目前还未获得我国转基因生物安全证书，尚未批准其进口。转基因苜蓿通过饲料进入动物养殖的食物链，致使牛奶、肉等制品成为转基因食品，可能对于人的健康产生影响。根据《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物进口安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》，凡是在中国境内销售的转基因生物，必须进行标识。对转基因产品标识需要检测方法的支撑。目前对转基因产品基于核酸基础上的检测可以分为4种检测策略:1)筛查法:对转基因产品中的启动子中的启动子、终止子等通用基因进行筛查；2)基因特异性检测:对转基因产品中的外源目的基因进行检测；3)构建特异性检测:对外源目的基因与启动子或终止子的特异连接序列进行检测；4)品系特异性/转化事件特异性检测:对外源片段与宿主基因组DNA特异连接序列进行检测。由于启动子、终止子、目的基因可以有多种组合关系，同一组合转化同一植物也可产生不同转化事件，特别对于进境监管，同一种作物有些转基因品系是允许进口，而有些品系可能由于某种原因没有区得准入。因此筛查法、基因特异性检测和构建特异性检测具有局限性，不能完全满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。而品系特异性/转化事件是指某个外源基因表达框(或片段)插入到宿主基因组某个位置而形成的稳定遗传转化。因此转化事件一旦发生就具有唯一性，针对转化事件的检测可以起到身份识别的作用。。2000 年，Notomi 等开发了环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplificat1n, LAMP)，其原理是针对目的核酸片段的设计特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在约62°C进行等温扩增。该方法具有灵敏度高，特异性好，反应时间短，判定结果方便、不需要昂贵仪器等优势。但是，针对不同的检测对象，引物的筛选以及针对性的扩增和检测条件是获得高灵敏度、高特异性结果的关键，对于同一种检测对象，采用不同的引物组合，其检测结果也相差甚远。目前未见到有转基因苜蓿草JlOl该作物品系特异性LAMP可视化检测方法相关文献报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有转基因苜蓿草采用的筛查检测技术不能准确地检测具体的转基因品系的不足，提供一组转基因苜蓿草JlOl品系特异性LAMP检测用引物，该组引物具有高特异性和灵敏度，基于所述引物及其组合，本专利技术可成功建立转基因苜蓿草JlOl品系特异性LAMP可视化检测方法。本专利技术要解决的另一技术问题是提供转基因苜蓿草JlOl品系特异性LAMP可视化检测方法。本专利技术还一要解决的技术问题是提供所述检测方法的应用。本专利技术的上述目的通过以下技术方案予以实现:本专利技术通过创造性地分析和大量实验研宄总结，在转基因苜蓿草J163品系的3‘端外源插入片段E9 3与苜蓿草基因组DNA之间的邻接区序列，结合序列信息的分析，设计得到一组共六条特异性的引物。并确定了精确地检测步骤和条件，建立特异性强、灵敏度高的转基因苜蓿草JlOl品系特异性LAMP可视化检测方法，满足转基因产品身份验证等检测、监测和安全管理的需求。具体地，本专利技术提供一组转基因苜蓿草JlOl品系特异性LAMP检测用引物F3、B3、FIP、BIP、LF 和 LB，所述引物的序列分别如 SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQID N0.4、SEQ ID N0.5 和 SEQ ID N0.6 所示:SEQ ID N0.1:F3:5’ -TTCCAGAATCCTTGTCAGATTC-3 ’。SEQ ID N0.2: B3:5 ’ -GCTGGAATTAGCAAGATAAG-3 ’。SEQ ID N0.3:FIP:5’-ATCGATGCGGCCACCACTGACTTGCCAATTGATTGACAAC-3’。SEQ ID N0.4: BIP: 5’ -CCCATTTGGACGTGAATGTAGATTAATGCATACGATCCGTCG-3’。SEQ ID N0.5: LF: 5 ’ -GGCTGCAGGTCGATTGAT-3 ’。SEQ ID N0.6: LB: 5 ’ -CACGTCGAAATAAAGATTTCCG-3 ’。本专利技术同时提供一种转基因苜蓿草JlOl品系特异性实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤:S1.提取DNA作为反应的模板；S2.采用所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB进行LAMP可视化检测，根据检测结果进行判断；其中，S2步骤所述实时荧光PCR检测反应体系为25 μ L: 10XThermopolbuffer2.5 μ L、F3 和 B3 各 0.5 μ L (10 μ Μ)、FIP 和 BIP 各 I μ L (40 μ Μ)、LF 和 LB 各0.5 μ L (40 μ Μ)、dNTPs 4 μ L (1mM)、MgSO4I μ L (10mM)、Bst DNA polymerase I μ L (8U/μ L)、Template DNAl μ L 和 11.5 μ L ddH20。S2步骤所述检测的反应程序为:63°C恒温反应60min，85°C加热2min使酶失活，反应即结束。优选地，S2步骤所述实时荧光PCR检测反应体系中MgSO4浓度为2mM。根据检测结果进行判断的方法可以采用以下两种方法的其中之一:方法一:根据颜色变化进行结果判断:向反应终体系加入0.2 μ LSYBR green I，Imin观察结果，阳性反应呈现黄绿色，而阴性的反应保持橙色；方法二:电泳检测判断:根据LAMP法扩增的产物是各种不同长度的茎-环状结构DNA,因此阳性反应的产物经过1.5%琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现。本专利技术同时提供了所述方法的应用，应用于鉴别转基因苜蓿草JlOl品系与其他作物。尤其是应用于与转基因玉米品系MIR162、转基因玉米品系89034、转基因玉米品系BT11、转基因大米cry IA(a/b)、非转基因油菜籽、非转基因小麦、非转基因大叶苜蓿的检测鉴别方面。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于:本专利技术根据苜蓿草终止子(E9 3)与内源苜蓿草基因组DNA邻接区序列，首次设计了 JlOl品系特异性的LAMP检测用引物，外引物F3和B3覆盖了邻接区区域，可以实现对JlOl品系特异性鉴别。本专利技术筛选的设计和筛选的引物组，首次实现成功采用LAMP方法对JlOl进行品系特异性的鉴定。本专利技术还对启动子与苜蓿草基因组DNA邻接区序列采用LAMPdesigner进行引物设计尝试，无法获得合适的LAMP反应的引物。本专利技术首次提供了一组共6条引物，该组引物对邻接区序列的6个特异序列区的识别，保证了本专利技术检测方法LAMP扩增的高度特异性；本专利技术设计的环引物使得扩增效率进一步大大提尚，耗时短，在Ih内可实现对JlOl品系的鉴定。本专利技术的扩增体系均在等温条件下采用特异性酶进行扩增，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组转基因苜蓿草J101品系特异性环介导等温扩增检测用引物，其特征在于，所述引物为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述引物的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘二龙，吕英姿，卢丽，蒋湘，樊武疆，姚柏辉，王定国，苏彩珠，唐婕，林惠娇，郑高彬，林学勤，符其娇，秦焯敏，
申请(专利权)人：中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44
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