本发明专利技术提供了丙型肝炎病毒一步法基因分型RT-PCR检测试剂盒，试剂盒包括RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、HCV分型引物探针、内参、阴性对照、1型阳性对照、2型阳性对照、6型阳性对照和1／2／6型阳性对照。本发明专利技术可对提取好的HCV RNA直接进行一步法RT-PCR反应，对样本中的HCV RNA进行基因分型检测，并依靠内参基因作为内对照、利用UNG酶预防污染。本发明专利技术的试剂盒一步法扩增方法简单、程序简短、操作简便、预防污染，检测结果特异性强、敏感度高、结果明晰、可信度高，可用于血清中丙型肝炎病毒1型、2型和6型的基因分型检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生物
，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于检测丙型肝 炎病毒的基因分型检测试剂盒。
技术介绍
病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的，以肝脏损害的一组全身性传染病。丙型肝 炎病毒（hepatitis C virus，HCV)是丙型病毒性肝炎的主要致病病毒。HCV基因组序列具 有高度变异性，根据不同区域的基因序列变异情况，HCV可分为1、2、3、4、5和6型等6个基 因型和80多种基因亚型。丙型肝炎病毒的遗传多样性对疾病进程及药物治疗反应性都有 很大影响。近年来的研究表明，HCV的基因型与丙型肝炎的治疗方案及治疗周期关系密切。 目前，临床上更多应用干扰素和利巴韦林联合治疗HCV。研究表明，不同基因型 HCV感染者在用a-干扰素联合利巴韦林治疗过程中所产生的持续病毒学应答（sustained virological response，SVR)比例有所不同：1、4、5和6型持续病毒学应答比例为30%，2 和3型持续病毒性应答比例为65%。且，1型HCV的体内复制速度明显高于其他基因型，lb 患者肝脏组织学分级、病程进展速度也明显高于2型。 中国流行的HCV有1型、2型、3型和6型等4种基因型。2011年针对我国汉族CHC 病毒基因型和宿主基因型的横断面研究纳入了 997例初治患者，结果显示最主要的HCV基 因型为1型，占58. 4%，其中lb亚型占所有基因型的56. 8%，表明在我国"难治性丙型肝 炎"占主导；2型次之（24. 1% )，之后为3型（9. 1% )、6型（6. 3% )和混合感染（2. 1% )， 未发现4型和5型。1型和2型在全国范围广泛分布，3型和6型主要见于南方和西南（如 云南、广西壮族自治区、广东、福建等），2种型加起来可占到这些地区基因型的40%左右。 由此可见，HCV基因分型在HCV感染、传播、诊断、诊疗、预防等方面均有重要意义， 可作为HCV感染的诊断和重要的预后指标，有助于针对不同HCV基因型感染患者用药剂量 及相关疗程的监测。结合HCV各基因型对干扰素治疗所产生的持续病毒学应答的差异及其 在中国的流行态势，区分HCV1型、2型和6型对丙型肝炎临床诊断治疗具有重要的现实意 义。 临床上，丙型肝炎病毒（HCV)的诊断主要依赖实验室检查。对HCV检测诊断的主要 方法有：丙型肝炎病毒抗体（抗HCV)的检测和多聚酶链法（PCR)检测丙型肝炎病毒核糖核 酸（HCV-RNA)。在实验室诊断技术中，放射免疫诊断（RIA)或酶联免疫试验（ELISA)是确诊 HCV感染的金标准，但检测的准确率受方法学的灵敏度以及操作者的熟练程度、标本质量等 因素影响。 当前，基于TaqMan探针技术的荧光定量PCR是融汇了 PCR高敏感性、DNA杂交技 术高特异性和光谱技术高精确定量三大技术的一种新的检测方法，该方法取材简单，操作 方便，完全封闭式操作避免了检测时的标本被污染和对环境的污染，能简便、微量、快速、高 特异、高敏感、定量、无污染地检测丙型肝炎病毒，还可以以量化指标来评估疗效。因此，荧 光定量PCR法是临床早期诊断HCV感染的最有价值的方法之一。 TaqMan探针技术是高度特异的荧光定量PCR技术。TaqMan探针是一种寡核苷酸 探针，荧光基团连接在探针的5' -末端，淬灭基团在探针3' -末端。当探针完整或与靶序 列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'-端的淬灭基团接近而被淬灭，无荧光信号产生。在 进行PCR反应延伸过程时，TaqDNA聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性将探针降解，使得荧 光基团与淬灭基团分离，即产生荧光信号。每经历一个PCR反应循环，就有一分子的扩增产 物生成，并伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团 信号不断积累，为一个指数同步增长的过程，荧光信号的强度就代表了扩增产物的拷贝数。 该技术具有特异性强、自动化程度高等特点、有效解决了 PCR污染等问题。HCVRNA荧光定 量检测正是基于这种原理设计，为HCV早期感染诊断、大规模筛查、疗效动态分析、新药开 发等提供良好的技术支持。目前，国际上HCV核酸分型检测试剂主要有以下几种：VerSant HCV Genotype Assay (LiPA) 2.0 和 INNO-LiPA HCV II (Innogenetics)等获得欧盟 CE 认证。 国内有2家公司研制出了 HCV核酸分型检测试剂，均已获国家生产许可。 同时为避免反应结果的假阳性，利用UNG酶防污染的特性，在PCR扩增反应中用 dUTP代替dTTP，这样仅在扩增片段中含有dUTP ;而dUTP使污染的扩增子在扩增靶DNA前 易于被UNG酶降解：这种含有dUTP的PCR产物与UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶 碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可从单链或双链DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合 酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG酶在50°C以上即失去活性，这样经过热循环不会 破坏病人HCV RNA。UNG酶对不含dUTP的模板无任何影响，因此，反应体系中只有从HCV阳 性病人样本血清中提取的HCV RNA因不被UNG酶降解而直接进行RT-PCR反应。 而且，将人造的竞争性内参RNA(慢病毒）引入反应体系，以指示每个PCR反应管 的扩增情况，从而避免假阴性或部分抑制结果的出现。 该技术通过对HCV各基因型序列比对分析，获得针对HCV1型、2型和6型的通用 引物及各自特异性的荧光探针，通过检测各种HCV标准血清及临床血清，确定该试剂盒的 各种检测指标，确定该试剂盒检测的特异性、灵敏度，为HCV的确诊、大规模筛选、病情程度 判断、疗效评价、新药开发等提供一个方便、廉价的检测手段。其关键技术为获得针对各种 HCV1型、2型和6型的通用引物及各自特异性的荧光探针，制备高特异性、搞敏感性、重复性 好的HCV基因分型RT-PCR检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：提供一种精确简便的用于丙型肝炎病毒RNA基因分型检测的 方法；另一目的在于提供一种用于该方法的试剂盒。 本专利技术的技术方案为：提供一种丙型肝炎病毒基因分型检测方法及试剂盒，采用 一步法RT-PCR技术对丙型肝炎病毒RNA进行基因分型检测。在使用上海复星长征医学科 学有限公司生产的磁珠法纯化试剂对HCV阳性血清样本进行核酸提取后，直接配制反应体 系进行扩增，反应体系配制方便，扩增程序步骤简便，扩增时间短，无需多次重复循环、防止 产物污染。本专利技术方法操作简便、敏感度高、结果明晰、可靠性高。 本专利技术提供的试剂盒包括：RT-PCR反应液、RT-PCR酶混合物、HCV分型引物探针、 内参、阴性对照、1型阳性对照、2型阳性对照、6型阳性对照和1 / 2 / 6型阳性对照。其中， 所述的 RT-PCR 反应液为 Tris-HCl (pH8. 3) 20mM、KCl 100mM、明胶 0? 2mg / ml、dATP、dGTP、 dCTP、dUTP各0. 4mM、MgCl2 6mM的混合液；所述的酶混合物为逆转录酶、Taq DNA聚合酶和 UNG酶的混合物（逆转录酶3U / iil，Taq DNA聚合酶2U / iil，UNG酶1U / ill);所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种丙型肝炎病毒一步法基因分型RT‑PCR检测试剂盒，其特征在于：本专利技术通过考察丙型肝炎病毒基因组全序列，并对检索所得HCV各个基因型一致性保守序列，根据该保守序列设计出一对HCV特异性引物、一条HCV1型特异性荧光探针、一条HCV2型特异性荧光探针、一条HCV6型特异性荧光探针、和一条内参探针，采用实时荧光定量PCR方法扩增目的基因。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：迟大利，吴大治，夏懿，
申请(专利权)人：上海星耀医学科技发展有限公司，上海复星医药集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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