本发明专利技术石蒜绵粉蚧特异性SS‑COI引物对及快速PCR检测方法和试剂盒。所述引物对包括引物PSLRZZF1：5′‑TTTTTGGATTTTGATCAGG‑3′；和引物PSLRZZR1：5′‑AACCATTTAAATGTAAAGAA‑3′。该引物只对石蒜绵粉蚧具有扩增能力，扩增产物大小为393bp，对单粒卵、初孵若虫及成虫残体亦有良好的检测效果。是对石蒜绵粉蚧形态学检测鉴定方法的补充和改进。同时，本发明专利技术采用SS‑COI PCR技术，提高了检测的准确性，节约了检测时间，可以试剂盒的形式在我国口岸、有机蔬菜和鲜切花生产基地，以及蔬菜、观赏植物种苗/植株调运中推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地，本专利技术涉及石蒜绵粉蚧特异性SS-C0I引物 对及快速PCR检测方法和试剂盒。
技术介绍
石蒜绵粉蚁PhenacoccussolaniFerris，属半翅目、粉蚁科、绵粉蚁属，是2008年 7-9月份发现的我国大陆未曾报道的一种新害虫。石蒜绵粉蚧的寄主范围十分广泛，已有 的研宄表明它的寄主植物有35科59种加18属植物，包括蔬菜、园林植物、果树、中草药、烟 草、杂草和灌木等，严重受害的植物有茄科的番茄、茄子、辣椒、甜椒、烟草等；十字花科的甘 蓝、萝卜等；豆科的豇豆、黄芪等；萌芦科的丝瓜等；姜科黄姜属植物；菊科的神仙草、菊花、 紫背草、灯盏花、弗氏菊、半带草等；石蒜科的网纹孤挺花和朱顶红属的其他植物，以及亚马 逊百合、网球花、水鬼蕉、金花石蒜、水仙花、纳丽石蒜、韭莲；五加科的伞树；萝摩科球兰属 植物；紫草科砂引草属植物和白水木；仙人掌科的三角柱；藜科的滨藜及藜属植物；景天科 拟石莲花属植物；苏铁科的非洲苏铁；莎草科的油莎豆；大戟科的大戟、麒麟掌；草海桐科 的草海桐；禾本科格兰马草属植物和狗尾草；鸢尾科鸢尾属植物；唇形科的黄花稔、半枝莲 等；百合科天门冬属植物；锦葵科的小花锦葵、圆叶锦葵、赛葵等；兰科植物；列当科列当属 植物；寥科寥属植物；马齿苋科的马齿苋；芸香科的来檬；玄参科的火焰草；伞形科的刺芹； 马鞭草科的马缨丹；堇菜科堇菜属植物；爵床科的白鹤灵芝草；番杏科的松叶菊；夹竹桃科 的球兰；天南星科的滴水观音等。石蒜绵粉蚧主要以雌性成虫和若虫群居在寄主植物的幼 嫩部位进行刺吸为害，为害部位包括嫩枝、嫩叶、嫩梢、花芽和叶柄，受害植株长势衰弱，生 长缓慢或停滞，失水干枯，亦可造成蕾、花、叶片等大量脱落；而成虫和若虫分泌的蜜露诱发 的煤污病不仅严重影响植物的光合作用，还可导致叶片枯萎脱落，植株成片死亡，严重影响 了观赏植物的观赏价值以及烟草、番茄、辣椒、马铃薯等经济作物的产量和品质。以往的研 宄显示，在津巴布韦石蒜绵粉蚧是烟草和窖储马铃薯的一种主要害虫，而在美国佛罗里达 州主要危害观赏植物，在以色列主要危害甜椒。 石蒜绵粉蚧最初在美国加利福尼亚州圣克鲁斯镇的一种菊科半带草属植物 (Hemizoniarudis)的根部发现，随后因为其在夏威夷发生危害而受到重视，并且被记录和 命名。后随寄主植物及其它介质传播扩散，主要在美国的夏威夷州、佛罗里达州等10个州 以及巴西、加拿大（不列颠哥伦比亚省）、库腊索岛、厄瓜多尔、危地马拉、墨西哥、特立尼达 岛、委内瑞拉等国发生，在南非、津巴布韦、夏威夷群岛、基里巴斯、吉巴特岛以及地中海盆 地的西西里岛等其他的动物地理区域零星发生，此外，在新加坡、越南、泰国、伊朗、土耳其、 以色列、意大利、佛得角、马绍尔群岛、秘鲁、波多黎各、荷属安的列斯和多巴哥以及我国的 台湾地区等地也有分布。我国大陆于2008年在北京植物园温室三角柱和麒麟掌以及新疆 乌鲁木齐市新疆农业大学温室的神仙草、球兰、伞树、狗尾等上首次发现石蒜绵粉蚧，近期 的调查又在福建、海南等省区发现其踪迹，对我国的蔬菜、花丼及中草药生产构成了巨大威 胁。因此，加强对石蒜绵粉蚧的监测检测，是保障我国蔬菜花丼产业和中药产业健康发展的 必要前提。 石蒜绵粉蚧为小型昆虫，雌雄异形，雌性成虫卵圆形，体被白色蜡粉，体长 2. 3-2. 7_，体宽1. 3-1. 6_。可营孤雌生殖和两性生殖。雌性成虫将卵产于生殖孔附近的 棉絮状的卵囊内，初孵若虫活跃，从卵囊爬出后短时间内即可取食危害。而加强检疫和监测 必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于石蒜绵粉蚧鉴定的方法主要有： 1)形态特征鉴定；2)PCR技术等。但目前国内针对石蒜绵粉蚧尚没有标准的检测方法。 COI技术曾用于鉴别石蒜绵粉蚧及其近缘种。mtDNACOI技术检测是利用通用型 的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测 序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。SS-COIPCR技术检测是在mtDNACOI 技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条 带的有无来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重 现性好和稳定性强等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供石蒜绵粉蚧特异性SS-COI引物对。 本专利技术的再一目的为提供一种石蒜绵粉蚧特异性基因片段。 本专利技术的另一目的为提供一种石蒜绵粉蚧的特异性快速PCR检测方法。 本专利技术的再一目的为提供一种石蒜绵粉蚧的特异性快速PCR检测试剂盒。 本专利技术根据石蒜绵粉蚧的线粒体DNA序列，设计一对种特异性引物，该引物只对 石蒜绵粉蚧具有扩增能力。是对石蒜绵粉蚧mtDNACOI技术检测方法的补充和改进。同时， 本方法采用SS-COIPCR技术，提高了检测的准确性和灵敏度，节约了检测时间，在石蒜绵粉 蚧检测监测方面具有很高的应用价值，可以试剂盒的形式在我国口岸、有机蔬菜和鲜切花 生产基地，以及蔬菜、观赏植物种苗/植株调运中推广。 根据本专利技术的一对石蒜绵粉蚧特异性SS-COI引物为： 引物PSLRZZF1:5' -TTTTTGGATTTTGATCAGG-3';和 引物PSLRZZR1 :5' -AACCATTTAAATGTAAAGAA-3，。 根据本专利技术的石蒜绵粉蚧特异性基因片段的核苷酸序列如PSLRZZIDN〇:3所示。 根据本专利技术的石蒜绵粉蚧种特异性检测方法包括使用上述SS-COI引物进行PCR 扩增的步骤。 根据本专利技术的石蒜绵粉蚧种特异性检测试剂盒包括上述石蒜绵粉蚧特异性 SS-COI引物。 本专利技术的石蒜绵粉蚧种特异性SS-COI引物及快速PCR检测方法，用于快速检测石 蒜绵粉蚧。与国际现有方法相比，本专利技术具有以下的技术优势： 1)检测准确性高。本方法根据石蒜绵粉蚧种特异性SS-COI标记设计的引物 PSLRZZF1和PSLRZZR1，在PCR快速检测石蒜绵粉蚧时，可扩增出393bp的片段，不仅对石蒜 绵粉蚧的单头雌性成虫、2龄和3龄若虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵若虫也能准 确检测。 2)操作简便快捷。本专利技术采用PCR技术，操作过程简单、快速、高效。一般整个过 程可在5个小时内完成。 3)特异性强。本专利技术设计的引物可特异性检测石蒜绵粉蚧，在其近缘种、属粉蚧中 无扩增产物。 因此本方法实用性强，可满足植物检疫及害虫监测/当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
石蒜绵粉蚧特异性SS‑COI引物对，其特征在于，包括以下引物：引物PSLRZZF1：5′‑TTTTTGGATTTTGATCAGG‑3′；和引物PSLRZZR1：5′‑AACCATTTAAATGTAAAGAA‑3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张桂芬，田虎，王玉生，万方浩，冼晓青，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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