一种AFP/HBsAg双靶向Dexosome抗肝癌瘤苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种AFP/HBsAg双靶向Dexosome抗肝癌瘤苗的制备方法，利用重组人腺病毒载体将肝癌相关抗原AFP基因作为靶点之一，并结合我国原发性肝癌的特点，将肝癌相关病毒特异性抗原HBsAg，联合作为免疫治疗靶点，导入DC，提取Dexosome制备新型双靶点抗肝癌瘤苗，增强其诱导的抗肝癌免疫效应。新型的Dexosome瘤苗可通过MHC-I/II类分子同时结合抗原肽，既可活化CD8+细胞毒性T细胞，亦可活化CD4+辅助T细胞。此方法克服既往针对单一肿瘤抗原诱导免疫效应弱及DC制备复杂等问题，提供一种新型非细胞性Dexosome抗肝癌瘤苗的制备方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于肿瘤生物免疫治疗领域，具体涉及AFP/HBsAg双革E1向Dexosome抗肝癌 瘤苗的制备。
技术介绍
原发性肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，流 行病学资料显示乙型肝炎表面抗原阳性人群肝癌发病率是其他人群的12-300倍。我国人 群HBV的携带率在10%左右，而90%的原发性肝癌患者发现HBsAg阳性。尽管目前对原发 性肝癌的治疗已取得一些进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想。 因此，有必要探索一种新的、有效治疗途径。随着人类肿瘤抗原以及肿瘤抗原基因的发现和 确认，为肿瘤的免疫治疗尤其是主动性免疫治疗提供了新的手段。 既往树突状细胞瘤苗已进行相关抗肝癌免疫治疗的研宄，其策略是在体外以肝 癌抗原冲击树突状细胞（dendriticcell，DC)使其致敏并活化，活化的DC在体内可有 效地摄取、提呈抗原，从而有效地激活肝癌抗原特异性杀伤性T淋巴细胞（CytotoxicT Lymph〇Cyte，CTL)反应。但是存在DC的体外培养繁琐、数量扩增有限、制备复杂、技术要求 高、难以质控、激发的免疫效应弱等问题。DC细胞来源的Dexosome，其表面富含MHC分子和肿瘤抗原，在免疫细胞间的物质 转运中发挥独特作用。研宄发现DC来源的Exosome可通过MHC-I/II类分子同时结合抗原 肽，既可活化CD8+细胞毒性T细胞，亦可活化CD4 +辅助T细胞，且其性质稳定，可长期保存， 宜临床上大量应用，已成为目前的研宄热点。Dexosome是活细胞分泌的亚细胞成份，目前己明确了其组成蛋白，主要包括非特 异性和特异性两类蛋白质分子。（1)非特异性的蛋白分子：在所有的Dexosome上都有分 布，主要包括细胞溶质蛋白、参与细胞内信号转导的蛋白、各种代谢酶、热休克蛋白（HSP)、 四跨膜蛋白（tetraspains)等。这些普遍存在的蛋白与抗原提呈相关，可结合抗原多肽 并携带至MHC分子。（2)特异性的蛋白分子：DC来源的Dexosome其表达DC的蛋白分子， 与Dexosome生物学功能密切相关。DC来源的Dexosome目前受到较多的研宄和关注。 Dexosome上含有向T细胞进行抗原呈递的所有生化物质，包括MHC-I和II类分子、热休克 蛋白（HSP)、乳合素以及重要的T细胞共同刺激物CD86。MHC-I和II类分子参与抗原处理与 T/B细胞限制性识别抗原。HSP73可能具有直接将分子运输至Dexosome的功能，推测HSP73 与抗原肽结合并运输至内吞小体的MHC-I类分子上。Dexosome含有丰富的MHC-I、MHC-II、CD86等重要的免疫分子。Hsu等检测了不同 环境下Dexo的MHC分子结合的肽段数量并评价其活化T细胞的能力，发现在无DC存在时， Dexo的MHC-I分子直接负载的肽段比DC存在时间接负载的肽段数量多。此外还发现Dexo 的MHC-II分子也可直接负载肽段。因此，Dexo具有通过MHC-I和MHC-II分子同时结合抗 原肽的特点，既可活化CD8+细胞毒性T细胞（CTL)，亦可活化CD4+辅助T细胞（Th)，从而 增强免疫应答效应。 与DC比较，Dexosome为非细胞成分，具有可长期冻存、抗原性弱、稳定高效等优 点，更宜于临床应用。美国Anosys公司于2002年建立了DC来源Dexosome的提取方法，并 建立GMP(GoodManufacturingPractice)标准。有报道Dexo已用于I期临床，对12例均 表达MAGE-3抗原的晚期恶性黑色素瘤患者进行了试验性治疗，获得了良好的效果。先将患 者的MD-DC体外培养7天后分离Dexo。第一组6例患者MD-DC负载MAGE-3抗原；第2组6 例患者MAGE-3抗原直接负载在Dexo上，冰冻保存，连续4周皮下或皮内注射，发现此组患 者治疗后病情稳定或肿瘤消退，在治疗过程中未出现3-4级毒性反应（毒性反应按NCICTC 标准分级）。第一组只有1例在治疗后病情获得稳定。第二组在注射小剂量Dexosome的患 者中，1例皮下转移灶消退，另1例在淋巴结部位有部分反应。在注射大剂量Dexosome的6 例患者中，3例在皮肤和淋巴结部位有肿瘤消退和长期的病情稳定，证实注射Dexosome是 安全的，并能获得肿瘤消退和长期稳定。目前认为，DC来源的Dexosome可能是免疫细胞之间相互传递信息的一种方式。但 是Dexosome在免疫网络中具体担负的角色及其生理意义仍不知道。从其表达MHC分子和共 刺激分子来看，Dexosome可能是APC呈递抗原肽和刺激T细胞活化的一种途径。目前公认 的是，APC质膜表面的MHC分子结合抗原肽以后，通过内吞形成多囊体，然后多囊体再向胞 外释放Dexosome。这些Dexosome携带了结合抗原的MHC复合物，能够被效应细胞捕获，或 者通过某种机制定向于效应细胞，然后和效应细胞的质膜融合而将抗原呈递给效应细胞。 同时Dexosome上存在的共刺激分子（⑶80,⑶86)将辅助淋巴细胞的活化。ChoJA等设计 了一个实验巧妙的证明了上述理论。作者将人肿瘤抗原MUC-1导入两种MHC类型完全不同 的小鼠细胞系中，然后发现小鼠细胞分泌的Dexosome携带上了导入的人肿瘤抗原，而且这 种携带人抗原的Dexosome能够激活小鼠的免疫系统，有效抑制表达MUC-1的肿瘤生长。因 此Dexosome能够成为投送肿瘤抗原的一个良好工具。 甲胎蛋白（&1口1^-€61:〇口1'(^6；[11，六??）在70%-80%的原发性肝癌（}1(工）中有较 高的表达水平。研宄证实将表达mAFP基因的小鼠肝癌细胞株H印a1-6接种C57BL/6J小 鼠，再用插入AFP基因的质粒DNA免疫小鼠，结果发现这种治疗性的免疫AFP质粒DNA能诱 发较强的特异性CTL免疫反应，部分小鼠产生了抗AFP抗体反应，并且表达AFP基因小鼠的 肿瘤出现消退，用AFP质粒DNA免疫的小鼠的生存期比其它小鼠也明显延长。由此说明， AFP能够作为一种潜在的诱导特异性的CTL反应的肿瘤抗原用于AFP分泌性肝癌的靶向性 免疫治疗。 已有多家报道利用AFP转染DC制备DC瘤苗，可以在体外诱导出特异性CTL反应。 但是其临床应用效果被证实远远低于体外实验，对已形成肝癌的治疗效果欠佳。那如何提 高AFP转染DC来源Dexo的抗肿瘤疗效至关重要。目前在提高Exosome的呈递效果和激活 作用方面，主要集中研宄如何使DC能够负载更多肿瘤抗原，发挥更大免疫治疗效应，人们 研宄了DC负载多种抗原的制备方法，包括：经照射的肿瘤细胞与DC共培养，肿瘤细胞来源 的RNA转染DC，腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏 DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗 原感染DC最为有效，但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供， 利用乙肝病毒表面抗原可作为HBV相关肝癌患者免疫治疗的相对特异的肿瘤相关分子，以 腺病毒为载体将AFP和HBsAg基因导入DC，提取Dexosom本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种AFP/HBsAg双靶向Dexosome抗肝癌瘤苗的制备方法，其特征在于所述的方法包括以下步骤：(1)制备表达人AFP、HBsAg基因的重组腺病毒载体；(2)外诱导培养肝癌患者外周血单个核细胞来源的树突状细胞；(3)含有人AFP、HBsAg基因的重组腺病毒载体体外共感染树突状细胞；(4)提取共感染的树突状细胞来源Dexosome；(5)制备AFP/HBsAg双靶向性Dexosome肝癌瘤苗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静悦，李宵，张红梅，刘文超，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61