一种融合蛋白及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合蛋白及其制备和应用。该融合蛋白为SEQNO.2所示序列，该融合蛋白由滞育关联蛋白3基因与载体连接后，得到的重组质粒转染大肠杆菌感受态细胞并诱导蛋白表达得到。本发明专利技术生产的DAP-3融合蛋白具有较高的SOD活性，能够作为超氧化物歧化酶使用，在抗氧化，延缓衰老，提高免疫力等方面的功效使得其在药品，化妆品的开发方面具有极大的潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及融合蛋白的
，具体涉及。
技术介绍
-、SOD制品的应用 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase)简称S0D，是一种广泛存在于自然界的生物 酶，按所含金属种类不同可分为铜锌S0D、锰SOD和铁SOD三种。现在市场上出售的SOD大 多都从血液中提取，属铜锌SOD (Cu/Zn-SOD)。Cu/Zn-SOD分子由两个亚基组成，每个亚基 含有一个铜离子和一个锌离子，分子量在32000左右。SOD是一种生物酶，其化学本质是蛋 白质，国内外对其毒性进行了广泛的研究。实验表明，它对人体无毒副作用，是一种纯天然 的生物活性物质。 由于SOD是一种特殊的生物酶，因此具有许多特殊的功能，目前国内外应用主要 集中在以下几方面： 1、作为药用酶原料 研究表明，机体内由各种原因产生的过量自由基，尤其是超氧阴离子自由基（02-)，它 与很多疾病如炎症、放射病、自身免疫性疾病、肿瘤及衰老等有关，而SOD是体内氧自由基 的专一清除剂，因此，它在治疗自身免疫性疾病(如类风湿性关节炎、肺气肿、红斑狼疮等)、 放射治疗、心血管疾病、延缓机体衰老等方面有明显的作用。作为药用酶，牛血SOD在美国、 德国、澳大利亚等国家已经有产品，商品名分别为0rgotein、0rmetein、0ntosein、Palosein 和Paroxinorm等。在我国，猪日血来源肌注SOD也已经通过卫生部的新药评审。 2、作为化妆品的添加剂 根据衰老自由基学说，老化是由自由基的产生和清除功能发生障碍造成的结果。在正 常情况下，自由基的产生与清除处于平衡状态，但随着机体的衰老和外界因素的影响，这种 平衡往往会被打破，多余的自由基就能通过多种渠道损伤机体。例如氧自由基能引起脂质 过氧化。过氧化脂质会同蛋白质交联，产生不溶性蛋白质。这种变化以结缔组织中胶原蛋 白最为明显，它能导致胶原变韧、长度缩短，使皮肤失去膨胀力，产生皱纹。此外，过氧化脂 质在氧化酶的作用下能分解产生丙二醛等化学物质，在体内迅速同磷脂酰乙醇胺交联生成 黄色色素，然后再与蛋白质、核酸、脂质等结合生成无生理活性的棕褐色的色素，即所谓老 年斑。经临床验证和长期使用表明，超氧化物歧化酶（SOD)是氧自由基的克星，它不仅能抗 皱、祛斑、去色素，还有抗炎、防晒、延缓皮肤衰老等作用。我国还将SOD添加到牙膏中，使牙 膏具有更强烈的消炎作用，用来治疗牙周炎等口腔炎症。 3、作为功能食品的强化剂 当SOD被证实口服有效后，世界各国争相开发SOD 口服产品。SOD保健品之所以能在众 多的保健品中异军突起，独占鳌头，主要是因为它具有以下几个功效： (1)增强免疫功能抗疲劳 SOD有明显增强免疫功能的功效。实验表明，SOD还有改善缺氧和增强耐疲劳的能力， 具有抗疲劳的效果。 (2)延年益寿抗衰老 服用天然超氧化物歧化酶（SOD)可以显著提高腺细胞中的SOD含量，具有确切的抗衰 老作用。 (3)治病防病有功效 SOD是氧自由基的克星，它能治疗由氧自由基引起的多种疾病。实验表明，它对胃肠道 功能失调、食欲不振、失眠、记忆力衰退、改善心血管功能，均有明显的防治作用。有人把它 的功能归之为"一清四抗"--清即有效清除体内多余的氧自由基(体内垃圾)，"四抗"即 抗衰老、抗疾病。抗辐射和抗疲劳。目前国内外正广泛应用在奶制品、糖果、果汁、饮料、啤 酒和保健胶囊(片剂）等中间。作为保健食品的特殊添加剂，SOD有着广泛的应用前景。 二、大肠杆菌表达系统 大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。与 其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期 短，抗污染能力强等特点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：一是现有技术SOD生产过程中从动物血液当中提取 的问题，包括动物血液的采集过程复杂，提取出来的组分不单一等问题；二是采取原核表达 系统来获得SOD产物，在确保活性没有丧失的情况下，避免了真核表达系统复杂，表达量相 对较低，纯化困难的问题。 为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用大肠杆菌表达系统高效表达柞蚕 dap-3基因得到的融合蛋白，该融合蛋白纯度高且具有很高的SOD活性。 本专利技术提供一种融合蛋白，该融合蛋白为SEQ NO. 2所示序列，该融合蛋白由滞育 关联蛋白3基因与载体连接后，得到的重组质粒转染大肠杆菌感受态细胞并诱导蛋白表达 得到。 优选地，所述滞育关联蛋白3基因从柞蚕中获得，其为SEQ NO. 1所示序列；所述载 体为pET28a ;所述重组质粒为pET28a-i/a/7-3。 优选地，所述大肠感受态细胞为BL21大肠杆菌感受态细胞。 本专利技术提供上述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤： a、 将滞育关联蛋白3基因与载体连接，得重组质粒； b、 将步骤a得到的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，筛选，得到含有所述重组质粒 的菌群； c、 步骤b得到的含有所述重组质粒的菌群诱导蛋白表达，得到融合蛋白。 优选地，所述滞育关联蛋白3基因从柞蚕中获得，其为SEQ NO. 1所示序列；所述载 体为pET28a ;所述重组质粒为pET28a-i/a/7-3。 优选地，步骤a以柞蚕为材料，由RT-PCR扩增的方法获得滞育关联蛋白3基因，通 过设计引物添加酶切位点及聖7 I和III，将pET28a与滞育关联蛋白3基因连接，构建 成重组质粒pET28a-￡/a/?-3。 优选地，所述大肠感受态细胞为BL21大肠杆菌感受态细胞。 优选地，步骤c为将步骤b得到的含有所述重组质粒的菌群接种培养基并加入诱 导剂，诱导蛋白表达，超声，纯化后得到融合蛋白。 本专利技术提供上述融合蛋白作为超氧化物歧化酶的应用。 本专利技术提供一种超氧化物歧化酶，其为上述融合蛋白。 本专利技术能够到达以下技术效果： 本专利技术利用大肠杆菌表达系统，将柞蚕DAP3大量表达，既能获得高活性的SOD制品，又 能降低成本，可规模化生产，以适应市场需求，其操作流程简单，生产周期短，基因来源方便 快捷，符合低碳经济理念，能结合产业化生产以满足市场的需要，有较为广阔的市场前景。 本专利技术生产的DAP-3融合蛋白具有较高的SOD活性，在抗氧化，延缓衰老，提高免疫力等方 面的功效使得其在药品，化妆品的开发方面具有极大的潜力。【附图说明】 图1是本专利技术的RT-PCR获得dap-3基因的PCR产物电泳图；其中，M:核酸分子量 标准；1 :目的基因 PCR产物； 图2是本专利技术重组表达载体pET-28a-dap-3鉴定图，其中M:核酸分子量标准；I :PCR 鉴定；2 :双酶切鉴定； 图3是本专利技术的融合蛋白表达及纯化图；M :蛋白分子量标准；I: pET-28a空载诱导；2: pET-28a-dap-3未诱导；3 :pET-28a-dap-3诱导；4 :超声后上清；5 :超声后沉淀；6 :镍柱纯 化。其中箭头所指示位置为目的蛋白。 图4是本专利技术融合蛋白纯化后SOD活性的测定图。【具体实施方式】 下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以 更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。 柞蚕体内DAP-3蛋白SOD活性 利用蛋白质分析系统（Exper本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白为SEQ NO.2所示序列，该融合蛋白由滞育关联蛋白3基因与载体连接后，得到的重组质粒转染大肠杆菌感受态细胞并诱导蛋白表达得到。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张耀洲，毕臻乐，杨晓丽，谭淑敏，舒特俊，陈剑清，
申请(专利权)人：天津耀宇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12