一种鸡传染性支气管炎血凝抑制抗体检测方法技术

本发明专利技术涉及本发明专利技术属于家禽疫苗技术领域，具体涉及一种鸡传染性支气管炎血凝抑制抗体检测方法，包括待检血清的处理和血凝抑制试验，待检血清的处理采用高岭土悬液作为血清处理液，在将上清液加入鸡红细胞血球泥，制得1:4稀释的待检血清；血凝抑制试验，25µl，1:4稀释的待检血清加入含4HA单位的抗原25µl进行血凝判定。用本发明专利技术中去除血清中非特异性反应的方法处理过的阴性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价均<1:4；用该方法处理过的传染性支气管炎阳性血清，传染性支气管炎血凝抑制效价降低0.5～1个滴度，去除了非特异性反应。提高了传染性支气管炎血凝抑制试验结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于家禽疫苗
，具体涉及一种鸡传染性支气管炎血凝抑制抗体检 测方法。
技术介绍
鸡传染性支气管炎（IB)是由传染性支气管炎病毒（IBV)引起的一种急性高度接 触性呼吸道疾病，以气管啰音、咳嗽、打喷嚏；幼鸡流鼻涕，产蛋鸡产蛋量减少和蛋的品质下 降为特征；患病的鸡常因呼吸道、肾脏或消化道感染而引起死亡。传支抗原特性，病毒本身 血凝性，须经特殊处理才能释放出凝集红细胞的受体，出现血凝性。目前传染性支气管苗的 效力检验主要采用攻毒保护方法。攻毒保护存在散毒风险，因此找到血清学替代方法非常 必要，血清学方法中血凝及血凝抑制最为简单可行。 目前国内外研宄的去除血清非特异性反应的方法很多，如加鸡红细胞处理、56°C 加热处理和加聚丙二醇处理等，但这些方法处理结果均不佳。另外传染性支气管炎血凝抑 制试验血清的非特异性反应就偏高，去除它的非特异性反应相对更难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鸡传染性支气管炎血凝抑制试验用血清处理液及处 理血清的方法，是针对去除传染性支气管炎血凝抑制试验中血清非特异性反应的方法。采 用本专利技术去除血清中非特异性反应的方法处理过的阴性血清，传染性支气管炎血凝抑制效 价均〈1:4。 本专利技术采用的技术方案是： ，包括待检血清的处理和血凝抑制 试验，其特征在于：具体步骤如下： 步骤1 :待检血清的处理 (1)取高岭土 25g，加0.85%生理盐水至100ml，即为25%的高岭土悬液，2~8°C 保存备用； (2)取40 μ 1待检血清，加入120 μ I (1)制备的血清处理液，振荡混匀，室温放置 30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液； (3)所得上清液中加入2 μ 1鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再 以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清； 步骤2 :血凝抑制试验 (1)取96孔V型微量反应板，每孔加入25 μ I PBS ; (2)分别吸取25 μ 1步骤1得到的1:4稀释的待检血清，加至每块的第一排各相应 孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释； (3)分别向各孔内加入含4ΗΑ单位的抗原25 μ 1，2~8°C静置30分钟； (4)每孔中加入0· 5%鸡红细胞悬液25 μ 1，轻轻混匀，2~8°C静置40分钟； (5)结果判定： 将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌 者判为血凝抑制，当阴性血清HI效价< 2. 01og2、阳性血清HI效价与规定效价相比误差 < 2. 01og2时，试验方可成立，以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。 优选的，步骤1中所述的鸡红细胞血球泥的制备方法为：加抗凝剂采SPF鸡血，用 PBS或生理盐水洗，轻轻混匀，3500r/min，吸去上清，如此反复洗3次，即得到鸡红细胞血球 泥。 所述抗凝剂为阿试液或肝素钠，均为市售产品。SPF指鸡的级别。 本专利技术的有益效果： 用本专利技术中去除血清中非特异性反应的方法处理过的阴性血清，传染性支气管炎 血凝抑制效价均〈1:4 ;用该方法处理过的传染性支气管炎阳性血清，传染性支气管炎血凝 抑制效价降低〇. 5~1个滴度，去除了非特异性反应，提高了传染性支气管炎血凝抑制试验 结果的准确性。【具体实施方式】 实施例1 -、抗原制备 1、将呼吸型IBV-M41株、腺胃型IBV-YBX株和肾型IBV-T株毒种分别用无菌生理 盐水100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. lml，置37°C鸡胚孵化箱孵化，24 小时照胚1次，弃去死胚。直至48小时，不论死亡与否，全部取出，置4°C冰箱冷却。按此方 法每种抗原制备3批。 其中，呼吸型IBV-M41株和肾型IBV-T株毒种，购于中国兽医药品监察所。腺胃型 IBV-YBX株为本申请人自行采集。 2、收集尿囊液，装入500ml离心瓶中，3000rpm离心30分钟，取上清。 3、将上清装入40ml离心管中，经30000g，4°C离心3小时。 4、弃去上清，每管各加入IM pH6. 5的Tris-HCL缓冲液，进行吹打，混匀，将病毒混 悬液收集于一管内。 5、取病毒混悬液加入2U/ml卵磷脂酶C等量混合。 6、将病毒混合物37°C水浴2小时，每隔15分钟振荡混匀。最后4°C过夜，为IBV-HA 抗原。 7、分别将IBV-HA抗原加入1 %硫柳汞，终浓度为0. 01 %，边加边混匀，混匀后4°C 保存。即得 M41-1 批、M41-2 批、M41-3 批；YBX-I 批、YBX-2 批、YBX-3 批；T-I 批、T-2 批、 T-3 批。 将以上9种抗原分别与稳定剂混合冻干。 二、待检血清的处理 1、取高岭土 25g，加0. 85%生理盐水至100ml，即为25%的高岭土悬液，2~8°C保 存备用。 2、用25%的高岭土悬液作为血清处理液，操作时取40 μ 1待检血清，加入120 μ 1 血清处理液，振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液。 3、用血球泥处理，于I. 3. 2所得上清液中加入约2 μ 1鸡红细胞血球泥，轻微振荡 混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清。 三、血凝试验 取96孔V型微量反应板对上述制备的抗原进行血凝效价检测，每孔加25 μ 1 PBS (0.0 lmol/L，pH值7. 0~7. 4)，第一排加25 μ 1抗原，并做2~4个重复孔，然后将抗原 进行2倍系列稀释，稀释后每孔再加入25 μ I PBS，最后再加入0. 5%鸡红细胞悬液25 μ 1， 用微量振荡器混匀，2~8°C静置40分钟判定结果，以使100%红细胞凝集的抗原最高稀释 倍数作为判定终点。结果制备的抗原的血凝价均在91og2以上，结果详见表1。 表1抗原血凝效价检测结果【主权项】1. ，包括待检血清的处理和血凝抑制试 验，其特征在于：具体步骤如下： 步骤1:待检血清的处理 (1) 取高岭土 25g，加0. 85%生理盐水至100ml，即为25%的高岭土悬液，2~8°C保存备 用； (2) 取40y1待检血清，加入120yI(1)制备的血清处理液，振荡混匀，室温放置30分 钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液； (3) 所得上清液中加入2y1鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再以 3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清； 步骤2 :血凝抑制试验 取96孔V型微量反应板，每孔加入25WPBS; 分别吸取25沿步骤1得到的1:4稀释的待检血清，加至每块的第一排各相应孔内，并 在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释； 分别向各孔内加入含4HA单位的抗原25W，2~8°C静置30分钟； 每孔中加入0. 5%鸡红细胞悬液25W，轻轻混匀，2~8 °C静置40分钟； 结果判定： 将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者 判为血凝抑制，当阴性血清HI效价< 2. 01og2、阳性血清HI效价与规定效价相比误差 &本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸡传染性支气管炎血凝抑制抗体检测方法，包括待检血清的处理和血凝抑制试验，其特征在于：具体步骤如下：步骤1：待检血清的处理（1）取高岭土25g，加0.85%生理盐水至100ml，即为25%的高岭土悬液，2~8℃保存备用；（2）取40μl待检血清，加入120μl （1）制备的血清处理液，振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液；（3）所得上清液中加入2μl鸡红细胞血球泥，轻微振荡混匀，室温放置30分钟，再以3000r/min离心10分钟，取上清液即为1:4稀释的待检血清；步骤2：血凝抑制试验取96孔V型微量反应板，每孔加入25µl PBS；分别吸取25µl步骤1得到的1:4稀释的待检血清，加至每块的第一排各相应孔内，并在每块板上设标准阳性血清和阴性血清对照，然后2倍系列稀释；分别向各孔内加入含4HA单位的抗原25µl，2～8℃静置30分钟；每孔中加入0.5%鸡红细胞悬液25µl，轻轻混匀，2～8℃静置40分钟；结果判定： 将反应板倾斜，凡血清反应孔与红细胞对照孔中红细胞以同样速度从孔底流淌者判为血凝抑制，当阴性血清HI效价≤2.0log2、阳性血清HI效价与规定效价相比误差≤2.0log2时，试验方可成立，以完全抑制4HA单位抗原的血清最高稀释度作为HI效价。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋新宇，王红，窦小龙，李陆梅，张恒，邹敏，史淑艳，程增青，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37