表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种表达人血清白蛋白的靶向载体，包含有人血清白蛋白基因，以及进行同源重组的鸡源的两个同源序列：5’同源臂、3’同源臂，同时还包含有进行药物筛选的neo基因和报告基因EGFP。本发明专利技术的表达人血清白蛋白的靶向载体可以用于制备转基因鸡，该转基因鸡繁殖后，其产生的卵（鸡蛋）中将会特异性地表达人血清白蛋白，而转基因鸡的其它细胞并不会表达人血清白蛋白，分离纯化方便，且由转基因鸡生产出来的人血清白蛋白在经过修饰之后更近似于人类体内正常的血清白蛋白，更有利于其发挥生物学功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可利用转基因鸡的鸡蛋生产人血清白蛋白的靶向载体，涉及自主 设计、克隆多个适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反应元件以及能够使人血清白 蛋白重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆，构成人血清白蛋白在鸡输卵 管组织特异性表达的基因打靶载体R〇SA26-shALBl，此载体的构建是后期获得能够在蛋清 中表达人血清白蛋白的转基因鸡的核心技术，属于基因工程

技术介绍
人血清白蛋白是由585个氨基酸组成的单链蛋白质，分子量为67kDa，白蛋白是血 浆中含量最高的蛋白质。白蛋白具有维持血液渗透压、抗休克、运输与解毒、促进肝细胞修 复与再生等作用，是国际上使用最多的血液制品。临床上主要用于烧伤、失血性休克、水肿、 低蛋白血症等的治疗。 医用血清白蛋白的传统获得方法是从健康人血浆中提取，但由于血浆制品具有污 染人原病毒的可能以及目前血液源的枯竭，使该方法受到很大限制，难以得到足够的血液 制品。目前我们国家每年需要白蛋白120吨，而通过献血能制备的白蛋白仅为所需求量的 1/3,因此，白蛋白供应严重紧缺。 目前重组生物制药中普遍采用酵母、大肠杆菌发酵制备，但此方法存在诸多的缺 点，例如：微生物与人体环境差异大，表达产品生物活性低、掺杂的微生物毒素难以彻底去 除，生产工艺复杂，很难形成规模化生产。因此，迄今为止，还没有相关产品上市。最近也有 国际公司利用转基因技术制备转基因动物来制备人重组蛋白产品，与传统的微生物表达系 统相比，动物生物反应器具有以下特点：1)生产的蛋白质生物活性高，能够对重组蛋白质进 行多种翻译后加工，非常接近天然产品；2)表达量大、成本低；3)产品易提纯、质量高，避免 了其他生产方式的化学及生物毒素的污染，安全可靠；4)易产业化：转移的目的基因能够 遗传，使某一群体都具有同一特性，可通过动物繁殖扩群，进行规模化生产。但人类基因是 随机插入动物的基因组内，虽然与微生物发酵相比有很大优势，但也存在着很多不可控的 因素和缺陷，有很大的改进空间：1)目的基因的整合与表达的效率较低；2)有可能引起宿 主细胞基因突变；3)转基因模型与预期结果不符，或表达个体的机能紊乱；4)动物本身的 相应的蛋白仍在表达，纯化中很难去掉，容易引起人类的过敏反应。因此，转基因动物还不 是理想的生物反应器。 综上，寻求一种合适的表达人血清白蛋白的方法是亟需解决的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种表达人血清白蛋白的靶向载体及其构建方 法。本专利技术构建的载体能够使人血清白蛋白整合在鸡基因组中并以鸡的卵清白蛋白为标靶 的进行基因敲入，将该载体转化入鸡的生殖细胞、得到转基因鸡后，其产生的卵（鸡蛋）中将 特异性地表达人血清白蛋白。本专利技术通过基因重组技术对鸡进行遗传修饰，改变其基因组 的组成，培育出能够在鸡卵(鸡蛋）中表达人类血清白蛋白的转基因鸡，并且确保这种遗传 修饰的改变能够被子代继承，长久的传递下去。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 为满足上述的实验设计，本专利技术将适合人血清白蛋白在鸡蛋蛋清中表达的调控反 应元件以及人血清白蛋白的基因重组于鸡卵清白蛋白序列的元件，并进行基因工程克隆， 构成人血清白蛋白在鸡输卵管组织特异性表达的基因打靶载体R〇SA26-shALBl，具体技术 方案如下： -种表达人血清白蛋白的靶向载体，构建图谱如图1所示，结构为：包含有人血清 白蛋白基因（序列如SEQ ID NO. 2所不，所表达的蛋白序列如SEQ ID NO. 1所不)，以及进打 同源重组的鸡源的两个同源序列：5'同源臂、3'同源臂，5'同源臂为1.7kb (SEQ ID NO. 3 所示)，3'同源臂为5. 2kb (SEQ ID NO. 4所示)，人血清白蛋白基因的5'端连接有kozak序 列，kozak序列为GCCACC，同时还包含有进行药物筛选的neo基因和报告基因 EGFP。 所述表达人血清白蛋白的靶向载体的构建方法，该方法的关键在于构建一种可以 准确的将人血清白蛋白插入到PGC细胞的基因组中并能够成功表达人血清白蛋白的基因 定点插入的载体，应用这种载体通过显微注射技术将完成遗传物质修饰的PGC细胞转入胚 胎中，能够获得转基因鸡。该转基因鸡的输卵管细胞以及生殖细胞可由被修饰的PGC细胞 发育而成，在形成卵的过程中表达产生人血清白蛋白，并且在其后代中稳定的传递转基因 修饰，产生子代转基因鸡。构建方法具体如下 ： 通过NCBI进行检索，得到目的基因（人血清白蛋白的基因）后，设计特异性引物， 进行5'同源臂、3'同源臂和人血清白蛋白基因的扩增（人血清白蛋白基因扩增后，在5' 端增加了一个kozak序列）；然后，以EGFP-R0SA-26基因打靶载体(该载体记载在参考文 献：Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Sasaki et al (Immunity. 2006Jun. 24(6) :729-39. PubMed))为基础，用于进行定点插入人血清白蛋 白基因整合：用pBluescript II SK( + )载体(商品化的载体)构建同源臂与人血清白蛋白基 因融合(先将5'同源臂重组到pBluescript II SK( + )载体上，再将人血清白蛋白基因重组 到pBluescript II SK ( + )载体上，利用特异性引物将5'同源臂与人血清白蛋白基因的融 合基因克隆下来)，然后将融合基因连接到EGFP-R0SA-26基因打靶载体上(利用infusion 试剂，该试剂为商品化产品），再将3'同源臂连接到EGFP-R0SA-26基因打靶载体上，即得表 达人血清白蛋白的靶向载体；所有序列经过PCR获得。 所述特异性引物如下： 用于扩增5'同源臂的引物为F1、F2: Fl :5, -CCGCGGCCGCTCTATGGCGTCAAAGGTCA-3,；如 SEQ ID NO. 5 所示； F2 :5, -CCCCCCGGGGAAAATGTAAGGATGG-3,；如 SEQ ID NO. 6 所示； 用于扩增人血清白蛋白基因的引物为F3、F4 : F3 :5' -CCCGGGGCCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTAT-3' ；如 SEQ ID NO. 7 所示； F4 :5' -CCATCGATTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3' ；如 SEQ ID NO. 8 所示； 用于扩增3'同源臂的引物为F5、F6 : F5 :5, -TTCCACATCCACCGGTTGGTTTATTTAGAGTGGCA-3,；如 SEQ ID NO. 9 所示； F6 :5, -GTTGGCGCCTACCGGACTGGCAGGGCTTATTTTCA-3,；如 SEQ ID NO. 10 所示； 引物F7, F8用于将连接到pBluescript II SK ( + )载体上的5'同源臂+人血清 白蛋白基因克隆并加上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达人血清白蛋白的靶向载体，其特征在于：包含有人血清白蛋白基因，以及进行同源重组的鸡源的两个同源序列：5’同源臂、3’同源臂，5’同源臂的序列如SEQ ID NO.3所示，3’同源臂的序列如SEQ ID NO.4所示，人血清白蛋白基因的5’端连接有kozak序列，同时还包含有进行药物筛选的neo基因和报告基因EGFP。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王向东，高鹏，魏光伟，李相芝，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37