本发明专利技术公开了一种裸卵小鼠生产方法，包括小鼠裸卵的体外发育和小鼠裸卵胚胎的体外发育两大步骤。本发明专利技术在体外环境条件下，利用Forskolin和PD166285模拟卵母细胞成熟过程中自然发育模式进行联合应用，在没有外源卵泡发育激素的作用下，Forskolin和PD166285联合应用能够使小鼠裸卵完全在体外培养条件下发育成熟，成熟的裸卵能够进行体外受精和诞生出新的小鼠个体，小鼠裸卵诞生出新生小鼠的产仔率能够达到11.11%，新生裸卵小鼠发育正常。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术涉及。
技术介绍
卵巢是卵子产生的发源地，卵子是自然界新生命诞生的重要生殖细胞。在自然状态下，卵巢内的卵子被周围大量的卵丘细胞包裹，卵丘细胞对于卵子的成熟质量和发育潜力发挥重要的影响。在现代社会中，伴随着面对各种生存压力的竞争和人类体质的下降，卵子周围的卵丘细胞出现凋亡和衰退，卵巢中形成大量裸卵，这也就是所熟知的早衰。在正常情况下，这些卵巢中的裸卵不能正常成熟，也不能同精子结合诞生出新的生命个体和后代。在现代不孕不育的人群和动物个体中，这样的群体占据较高的比例。因此，生殖健康日益成为人类所面临的重要问题。同时，在现代畜牧业中人类要求高产优质的畜产品，这些需要高产优质的家畜群体，优秀家畜群体的培育尤为重要。机体体细胞能够在体外诱导形成干细胞，干细胞等相关生物育种技术已迅速发展和成熟，干细胞在体外能够诱导发育形成裸卵，因此，体细胞来源的裸卵能够诞生出新个体将会为家畜育种现代化的发展提供重要平台和保障。小鼠作为研宄生殖发育的重要动物模型，如何使小鼠裸卵完全在体外培养条件下发育成熟，成熟的裸卵能够进行体外受精和诞生出正常新生的小鼠个体，是一个值得研宄的课题。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是:，包括以下步骤: (O小鼠裸卵的体外发育 取小鼠卵巢，用注射器针头刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母细胞释放到卵母细胞操作液中；挑选裸卵体外洗涤后，放入含50 μΜ Forskolin的卵母细胞成熟培养液中，裸卵在含50 μM Forskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3 h后，转移至含2.5μΜ ΗΗ66285的卵母细胞成熟培养液中继续体外培养16 h ； (2)小鼠裸卵胚胎的体外发育 取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，在HTF受精液与获能精子体外共同孵育培养6h，挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G-1 PLUS培养液中培养，成熟裸卵体外受精发育至2-细胞阶段时，移植发育至2-细胞阶段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠输卵管中，饲养代孕小鼠于胚胎移植20天后获得裸卵小鼠。作为优选，卵母细胞操作液为含HEPES和10% FBS的TCM199。作为另一个优选，卵母细胞成熟培养液为SAGE? In-Vitro Maturat1n Media。本专利技术的有益效果是: 在体外环境条件下，利用Forskolin和HH66285模拟卵母细胞成熟过程中自然发育模式进行联合应用，在没有外源卵泡发育激素的作用下，Forskolin和HH66285联合应用能够使小鼠裸卵完全在体外培养条件下发育成熟，成熟的裸卵能够进行体外受精和诞生出新的小鼠个体，小鼠裸卵诞生出新生小鼠的产仔率能够达到11.11%，新生裸卵小鼠发育正常。【具体实施方式】，具体步骤如下: (O小鼠裸卵的体外发育 取小鼠卵巢，用注射器针头刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母细胞释放到卵母细胞操作液中，卵母细胞操作液为含HEPES和10% FBS的TCM199 ;挑选裸卵体外洗涤后，放入含50 μ MForskolin的卵母细胞成熟培养液SAGE? In-Vitro Maturat1n Media中，裸卵在含50 μ MForskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3 h后，转移至含2.5μΜ TO166285的卵母细胞成熟培养液SAGE? In-Vitro Maturat1n Media中继续体外培养16 h ； (2)小鼠裸卵胚胎的体外发育 取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，在HTF受精液与获能精子体外共同孵育培养6h，挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G-1 PLUS培养液中培养，成熟裸卵体外受精发育至2-细胞阶段时，移植发育至2-细胞阶段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠输卵管中，饲养代孕小鼠于胚胎移植20天后获得裸卵小鼠。以上所述的本专利技术实施方式，并不构成对本专利技术保护范围的限定。任何在本专利技术的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的权利要求保护范围之内。【主权项】1.，其特征在于包括以下步骤: (O小鼠裸卵的体外发育 取小鼠卵巢，用注射器针头刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母细胞释放到卵母细胞操作液中；挑选裸卵体外洗涤后，放入含50 μΜ Forskolin的卵母细胞成熟培养液中，裸卵在含50 μM Forskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3 h后，转移至含2.5μΜ ΗΗ66285的卵母细胞成熟培养液中继续体外培养16 h ； (2)小鼠裸卵胚胎的体外发育 取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，在HTF受精液与获能精子体外共同孵育培养6h，挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G-1 PLUS培养液中培养，成熟裸卵体外受精发育至2-细胞阶段时，移植发育至2-细胞阶段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠输卵管中，饲养代孕小鼠于胚胎移植20天后获得裸卵小鼠。2.根据权利要求1所述的裸卵小鼠生产方法，其特征在于，所述卵母细胞操作液为含HEPES 和 10% FBS 的 TCM199。3.根据权利要求1所述的裸卵小鼠生产方法，其特征在于，所述卵母细胞成熟培养液为 SAGE? In-Vitro Maturat1n Media。【专利摘要】本专利技术公开了，包括小鼠裸卵的体外发育和小鼠裸卵胚胎的体外发育两大步骤。本专利技术在体外环境条件下，利用Forskolin和PD166285模拟卵母细胞成熟过程中自然发育模式进行联合应用，在没有外源卵泡发育激素的作用下，Forskolin和PD166285联合应用能够使小鼠裸卵完全在体外培养条件下发育成熟，成熟的裸卵能够进行体外受精和诞生出新的小鼠个体，小鼠裸卵诞生出新生小鼠的产仔率能够达到11.11%，新生裸卵小鼠发育正常。【IPC分类】A01K67-027, C12N5-073【公开号】CN104726397【申请号】CN201510113691【专利技术人】张飞, 曹鸿国, 牛梦涵, 贾镛, 章孝荣 【申请人】安徽农业大学【公开日】2015年6月24日【申请日】2015年3月16日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种裸卵小鼠生产方法，其特征在于包括以下步骤：（1）小鼠裸卵的体外发育取小鼠卵巢，用注射器针头刺破卵巢上卵泡，卵泡中卵母细胞释放到卵母细胞操作液中；挑选裸卵体外洗涤后，放入含50μM Forskolin的卵母细胞成熟培养液中，裸卵在含50μM Forskolin的卵母细胞成熟培养液中培养3 h后，转移至含2.5μM PD166285的卵母细胞成熟培养液中继续体外培养16 h；（2）小鼠裸卵胚胎的体外发育取经过成熟培养排出第一极体的裸卵，在HTF受精液与获能精子体外共同孵育培养6 h，挑选排出第二极体或形成雌雄原核的受精卵，在G‑1 PLUS培养液中培养，成熟裸卵体外受精发育至2‑细胞阶段时，移植发育至2‑细胞阶段的小鼠裸卵胚胎于代孕小鼠输卵管中，饲养代孕小鼠于胚胎移植20天后获得裸卵小鼠。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张飞，曹鸿国，牛梦涵，贾镛，章孝荣，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。