本发明专利技术涉及一种高效提取肝素钠的生产工艺,以终产物肝素钠效价做为指标,以猪小肠黏膜做为原料,通过酶解-树脂吸附/洗脱-膜分离-乙醇沉淀-干燥的生产工艺方法,从中提取高效价的抗凝血药物肝素钠。与传统的盐解-离子交换-乙醇沉淀法相比,酶法与膜分离技术和沉淀技术的有效结合,可以有效提高所提取肝素钠的效价至160U/mg,比传统方法提高近64%,最后回收率提高29%。同时,可以缩短后续精制工序,降低生产成本,提高肝素钠分离的收率和效率。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】(-)
本专利技术涉及一种高效提取肝素钠的方法,具体涉及一种利用酶法与膜分离技术和沉淀技术有效结合,从而高效提取肝素钠的生产工艺。(二)
技术介绍
肝素是一种由D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺和L-艾杜糖醛酸多种糖类组成的酸性黏多糖,广泛存在于哺乳动物肠黏膜、心脏、肝脏、肺、血液、胰腺和胎盘等组织中。具有良好的抗凝血、降血脂、促纤维蛋白溶解、抗中膜平滑肌细胞增殖等方面的活性,被广泛用于心脑血管疾病的治疗。肝素钠是肝素的钠盐形式,在肝素提取过程中将其以钠盐的形式制备,便于药效和活性的保存,同时可作为药物制剂使用。目前,肝素钠的工厂规模化生产多以猪、羊、牛的小肠黏膜及牛肺等为原料,采用盐解-树脂吸附/洗脱-乙醇沉淀的工艺方法进行。而这种工艺生产出的肝素钠产率低、效价低,且肝素钠精品的获得还需经过复杂的氧化、纯化等工艺过程,工作繁琐、成本居高。(三)
技术实现思路
本专利技术的目的提供一种酶解-树脂吸附/洗脱-膜分离-乙醇沉淀-干燥的生产工艺方法,通过酶法与膜分离技术和沉淀技术的有效结合,改善肝素钠提取工艺,获得高效价的肝素钠精品。如上构思,本专利技术的技术方案是:一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:包括如下步骤:①肠黏膜酶解:将收集的肠黏膜加水稀释至波美度为8-9,调节pH至8.0-10.0,加热煮沸变性10-20min,待温度降至50_55°C时,酶解,酶解液离心后,收集上清液;②树脂吸附:调节上清液pH至9-9.5,浓度调节至波美度为8-9,加入6%树脂,于室温下搅拌吸附10_12h ;③树脂洗涤与洗脱:吸附完成后,静置20_40min,吸去上层液体,然后漂洗树脂,最后搅拌洗脱树脂2次,每次时间4-5h,将两次洗脱液合并;④膜分离:将步骤④洗脱液边搅拌边用PAN膜浓缩,滤速为30-40mL/min,至膜上部分占总体积的10-15%时,停止浓缩过程,收集膜上残留部分;⑤乙醇沉淀:将步骤⑤收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇,密封静置过夜,使之充分沉淀,除去上层乙醇溶液;再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次,收集沉淀,将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥,即得分离纯化的肝素钠。上述步骤①的酶解条件是:加入l%(m/v)蛋白复合酶酶解,收集上清液;酶解保温2h ;离心的条件是:酶解液于4°C、4000r/min离心15min。 上述步骤②的树脂采用6%D254型树脂。上述步骤②搅拌速度为50_60r/min上述步骤③用分别用蒸馏水和1.2mol/L氯化钠漂洗树脂,加入I倍树脂体积的4mol/L氯化钠溶液洗脱。上述PAN膜截留分子量为3000-4000。上述蛋白复合酶为包含胃蛋白酶和胰蛋白酶的商用复合酶。本技术方案与传统工艺相比优点在于:酶法与膜分离技术和沉淀技术的有效结合,可以有效提高所提取肝素钠的效价至160U/mg,比传统的盐解-离子交换-乙醇沉淀法提高近64%,最后回收率提高29%。第1,本技术方案中,高温的碱性环境,可以使与肝素结合在一起的蛋白分子充分变性,酶解可以促使蛋白分子进一步变为小分子的多肽,因而更容易与肝素分离,同时,酶解温度为50-55°C,温和的酶解环境,可以保证蛋白酶的高活性,又有效保护肝素钠较少受蛋白酶的破坏,保持肝素钠产物的效价。第2,本技术方案中,酶解液先经过树脂吸附分离过程,可以将分子量大于肝素分子的蛋白、核酸、色素等其它杂质有效去除,减少下一步膜分离的负荷。第3,本技术方案中,膜分尚所用PAN膜截留分子量为3000-4000,可以将分子量大于肝素分子的小分子杂质有效去除,同时保证肝素钠产物的效价。第4,本技术方案中,膜分离的截留量保持在总体积15%左右,可以使大部分的小分子蛋白质、核酸及其他一些杂质被有效去除,又不使肝素钠效价丢失。(四)【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术做进一步说明:一种高效提取肝素钠的生产工艺,包括如下步骤:1、材料预处理新鲜猪小肠冲洗干净,剪开,用刀片刮取肠黏膜,收集至自封袋中,4°C保存备用。2、酶解将步骤I中收集的肠黏膜50kg加水稀释至波美度为8_9(波美计测量,4mol/L氯化钠调节浓度),调节PH至8.0-10.0,加热煮沸变性15min,待温度降至50_55°C左右时,力口入l%(m/v)蛋白复合酶,酶解保温2h,酶解液于4°C、4000r/min离心15min,收集上清液。3、树脂吸附调节上清液pH至9-9.5,浓度调节至波美度为8_9 (波美计测量,4mol/L氯化钠调节浓度),加入6%D254型树脂,于室温下搅拌吸附10-12h,搅拌速度为50_60r/min。4、树脂洗涤与洗脱吸附完成后,静置30min,虹吸吸去上层液体,分别用蒸馏水和1.2mol/L氯化钠漂洗树脂。然后加入I倍树脂体积的4mol/L氯化钠溶液,搅拌洗脱2次,每次时间5h,将两次洗脱液合并。5、膜分离将步骤4洗脱液边搅拌边用PAN膜(Mr3000-4000)浓缩,滤速为30-40mL/min,至膜上部分占总体积的15%左右时,停止浓缩过程,收集膜上残留部分。6、乙醇沉淀将步骤5收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇,密封静置过夜,使之充分沉淀,采用虹吸法除去上层乙醇溶液。再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次,收集沉淀。将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥8h,即得分离纯化的肝素钠15kg。【主权项】1.一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:包括如下步骤: ①肠黏膜酶解:将收集的肠黏膜加水稀释至波美度为8-9,调节pH至8.0-10.0,加热煮沸变性10-20min,待温度降至50_55°C时,酶解,酶解液离心后,收集上清液; ②树脂吸附:调节上清液PH至9-9.5,浓度调节至波美度为8-9,加入树脂,于室温下搅拌吸附10-12h ; ③树脂洗涤与洗脱:吸附完成后,静置20-40min,吸去上层液体,然后漂洗树脂,最后搅拌洗脱树脂2次,每次时间4-5h,将两次洗脱液合并; ④膜分离:将步骤④洗脱液边搅拌边用PAN膜浓缩,滤速为30-40mL/min,至膜上部分占总体积的10-15%时,停止浓缩过程,收集膜上残留部分; ⑤乙醇沉淀:将步骤⑤收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇,密封静置过夜,使之充分沉淀,除去上层乙醇溶液;再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次,收集沉淀,将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥,即得分离纯化的肝素钠。2.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:上述步骤①的酶解条件是:加入l%(m/v)蛋白复合酶酶解,收集上清液;酶解保温2h ;离心的条件是:酶解液于 4°C、4000r/min 离心 15min。3.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:上述步骤②的树脂采用D254型树脂。4.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:上述步骤②搅拌速度为50_60r/min5.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:上述步骤③用分别用蒸馏水和1.2mol/L氯化钠漂洗树脂,加入I倍树脂体积的4mol/L氯化钠溶液洗脱。6.根据权利要求1所述的一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效提取肝素钠的生产工艺,其特征在于:包括如下步骤:①肠黏膜酶解:将收集的肠黏膜加水稀释至波美度为8‑9,调节pH至8.0‑10.0,加热煮沸变性10‑20min,待温度降至50‑55℃时,酶解,酶解液离心后,收集上清液;②树脂吸附:调节上清液pH至9‑9.5,浓度调节至波美度为8‑9,加入树脂,于室温下搅拌吸附10‑12h;③树脂洗涤与洗脱:吸附完成后,静置20‑40min,吸去上层液体,然后漂洗树脂,最后搅拌洗脱树脂2次,每次时间4‑5h,将两次洗脱液合并;④膜分离:将步骤④洗脱液边搅拌边用PAN膜浓缩,滤速为30‑40mL/min,至膜上部分占总体积的10‑15%时,停止浓缩过程,收集膜上残留部分;⑤乙醇沉淀:将步骤⑤收集物中边搅拌边加入1.5倍体积的95%乙醇,密封静置过夜,使之充分沉淀,除去上层乙醇溶液;再分别用2倍体积的95%乙醇和无水乙醇各沉淀一次,收集沉淀,将所得沉淀于真空干燥箱中真空干燥,即得分离纯化的肝素钠。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:董浩,张秀民,罗志良,符绍辉,程榆茗,夏毅强,高振宏,
申请(专利权)人:安徽宝迪肉类食品有限公司,
类型:发明
国别省市:安徽;34
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