一种PCR酶联双杂交法检测病原微生物检测方法技术

PCR酶联双杂交法检测病原微生物属于临床医学微生物检测技术领域，具体为一种多种微生物同步定性和定量检测方法。本发明专利技术是结合应用DNA扩增，DNA杂交，和酶联免疫反应，采用固相表面包被技术，经过特异性保守片段的扩增，扩增产物与捕获探针结合，进一步吸附于固相表面，再经过酶联探针的远端杂交，经过特异性抗体识别,酶和底物的反应，产生可定量的颜色产物。所检测的病原微生物包括，EB病毒，巨细胞和胞病毒，单纯疱疹病毒1和单纯疱疹病毒2。本发明专利技术可实现对临床样本多种微生物同时检测，经过一个反应同时筛查四种病毒。具有节省时间和费用，应用灵活，重复性好、稳定性强、灵敏度及特异性高、简单易行的特点，适用于广泛的病原微生物检测；尤其适用于基层医疗机构。

【技术实现步骤摘要】
一种PCR酶联双杂交法检测病原微生物检测方法
本专利技术涉及临床医学微生物检测、水及环境等微生物检测领域，具体涉及微生物定量、定性检测领域。
技术介绍
临床医学微生物现阶段国内外检测方法主要有传统生化鉴定法、免疫学检测技术、核酸分子杂交技术、PCR技术、基因芯片技术等一些简单的分子生物学和免疫学方法。传统的生化鉴定法需要对待测样本接种在培养基上进行分离培养，通过一系列繁琐的生理生化实验的特征、结果来甄别病原体种类，该方法虽然是微生物实验室中一种常用的、经典的鉴别方法，但其过程往往需要数天时间、耗费较大的人力物力、实验得到的表型特征可能还受到外界环境影响而出错，特别对于一些处于“活的不可培养状态”的微生物，传统的培养方法难以培养、甄别，留下重大隐患。免疫学方法检测技术主要是采用酶联免疫分析(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA),是把抗原、抗体免疫反应的特异性和酶的高校催化作用有机地结合起来的一种检测技术，既可以检测抗原也可以检测抗体；既可以进行定性也可以进行定量测定。ELISA技术简繁、方便，较传统检测技术快速，但存在交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足。聚合酶链式反应(PloymeraseChainReaction,PCR)是分子生物学技术的一种，用于放大DNA片段，即生物体外进行的DNA扩增。一般的PCR需要经过预变性，变性、退火、延伸的25～35次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反应体系里加上二对以上引物，可同时扩增出多个核酸片段，适合多种微生物的同步分析与鉴定。但也存在扩增失败或非特异性产物，以及外源性污染出现假阳性结果。基因芯片(DNAchip)又称为DNA微阵列(DNAmicroassay)或DNA芯片，是生物芯片的一种，是核酸分子杂交技术发展延伸而来的。通过微加工技术，将数以万计甚至百万计的基因探针即DNA片段有规律地排列成二维DNA探针阵列，固定到硅片、玻片等固态支持物上，与标记的样品分子进行核酸杂交，用于基因检测工作。其测序原理与核酸杂交一样，但解决了传统核酸杂交技术操作繁杂、检测效率低、自动化程度不高的缺点。基因芯片技术价格昂贵，同样还有些问题有待解决，如提高芯片的特异性和检测信号的敏感性，降低芯片的制作成本等，而且多数芯片都需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术存在的不足，提出一种结合了PCR、DNA杂交和酶联免疫三项技术优势的多种微生物同步定性和定量检测方法。本专利技术采用的技术方案：应用经亲和素包被的酶标孔板，特异性结合生物素化捕获探针，使其固定于孔板之上。PCR扩增系统包含数对特异性引物，TaqDNA聚合酶，和病人样本提取物，可以选择性扩增其含有的病原体基因片段。扩增产物一端与捕获探针杂交，另一端与酶标记的特异性探针杂交，经过清洗除去未结和的探针，经底物显色，停止反应，读取光密度，从而得知该样本是否含有相应病原微生物和其数量(见图1)。PCR酶联双杂交法本方法结合现有技术的优点，应用多联扩增PCR,Avidin-Biotin亲和固相连接，双探针杂交，保证了很高的敏感性和特异性，同时可检测多个常见病原，应用灵活，节省人力物力。所述方法具体包括如下步骤：1)亲和素(Avidin)包被聚苯乙烯板子的制备链霉亲合素(Thermo)溶解在标准碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)在室温下过夜，使其最终浓度为5mg/ml。该板包被前经UV光照射20分钟。另外，亲和素包被的板可以从生命技术公司购买。2)样本来源本检测应用人体标本，包括体液，如分泌物，咽拭子混悬液，脑脊液，血清等。3)样本处理待测样品反复冻融3次，每次都要涡旋混匀。4)DNA模板提取和探针制备DNA提取用从液体中纯化DNA的试剂盒。这个试剂盒适合于液体里含有核酸的提取和纯化，如：咽拭子混悬液,脑脊液，血清尿液，痰液等.按厂家推荐的操作程序操作。5)多重PCR扩增目的片段CMV检测上游引物:5’-gttctcagccacaattactgag-3’下游引物:5’-caagcggcctctgataaccaag-3’捕获探针:5’-tcctcaatgcggcgcttcattacactgata-bio-3’标记探针:5’-tcctcaatgcggcgcttcattacactgataacctcaggct-dig-3’EBV检测上游引物:5’-gtcatcatcatccgggtctc-3’下游引物:5’-ttcgggttggaacctccttg-3’捕获探针:5’-aaaaggagggtggtttggaaagcatcgtggt-bio-3’标记探针:5’-atccgggtctccaccgcgcaggccccctccaggtagaagg-dig-3’HSV-1检测上游引物:5’-ggccgtgtgacactatcgtcca-3’下游引物:5’-gaggcccactatgacgacaaac-3’捕获探针:5’-atgggggggactgccgccaggttgggggccgtgattttgt-bio-3’标记探针:5’-tcgtccataccgaccacaccgacgaacccctaagggggag-dig-3’HSV-2检测上游引物:5’-ctcgtaaatgcttccctgct-3’下游引物:5’-gttgggggcggaataccata-3’捕获探针:5’-cgggccgcccgtggcgctcggtgcccccggtatggtattc-bio-3’标记探针:5’-cttccctgctggtgccgatctgggaccgcgccgcggagac-dig-3’PCR扩增体系：3’端DNA标记使用LifeTechnologyPierceTMBiotin3'EndDNALabelingKit试剂盒.DNA探针地高辛标记RocheDNA标记试剂盒.DNA提取用QiagenQIAquickPCRPurificationKit.DNA样品以50-200纳克/μl溶解于无菌蒸馏水中.5)PCR体系和扩增循环参数：DNA变性温度根据7Oligo软件计算。1cycleof10minat95℃94℃45S,57℃60S,and72℃40S共35Cycles1Cyclefor10minat72℃.PCR产物以QiagenPCRpurificationkit提纯1)双杂交酶联反应步骤杂交和检测反应生物素化的探针固定在亲和素包被的微量滴定板孔中加入50微升含有1％吐温的磷酸缓冲盐水和0.5μM生物素化的探针的溶液,37℃下孵育30分钟。用PBST将板在冰上洗涤三次,每次两分钟PCR产物变性将PCR产物加热到99℃10分钟，立即在冰上冷却。杂交100微升冰冷的杂交缓冲液：5×SSC〔1×SSC＝0.15MNaCl+0.015M柠檬酸钠,并含有1％封闭液(1％[wt/vol]封闭试剂[Boehringer],0.1％[wt/vol]十二烷基肌氨酸钠)〕,10mlPCR产物和0.5pM地高辛标记的探针在55℃孵育30分钟。然后用PBST将板洗涤三次本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCR酶联双杂交法检测病原微生物检测方法，其特征在于，所述方法是结合应用DNA扩增、DNA杂交和酶联免疫反应，生物素标记的DNA捕获探针经亲和反映，借助包被于孔板表面的Avidin，固定于孔板表面；PCR扩增产物一端与捕获探针杂交，另一端与地高辛标记的特异性探针杂交，经过HRP标记的地高辛抗体识别，酶与底物反应,经过清洗除去未结和的探针，经底物显色，停止反应，读取光密度，确定样本含有相应病原微生物及其数量。

【技术特征摘要】
1.一种多种微生物同步定性和定量检测试剂盒，其特征在于，其包括亲和素(Avidin)包被聚苯乙烯板、纯化DNA试剂和PCR扩增用引物及探针；所述PCR扩增用引物及探针为：CMV检测引物及探针：PCR上下游扩增引物为SEQIDNO.1,2所示；捕获探针3’末端是生物素标记，序列为SEQIDNO.3所示；标记探针3’是地高辛标记，序列为SEQIDNO.4所示；EBV检测引物及探针：PCR上下游扩增引物为SEQIDNO.5,6所示；捕获探针3’末端是生物素标记，序列为SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红卫，张绍渤，陈红岩，王金志，王琳，
申请(专利权)人：南京爱佩捷生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32