本发明专利技术公开了一种基于免疫金的电化学传感元件的制备方法，本发明专利技术制备了通用的硝基咪唑类结构半抗原，并采用活化酯法，将硝基咪唑半抗原与载体蛋白(BSA和OVA)偶联制备免疫原和包被原，偶联分子摩尔比分别为11:1和10:1。同时制备了硝基咪唑抗体，效价为1:100000，制备免疫纳米金；利用单分子膜自组装技术在金电极上形成单分子膜，再通过DCC和NHS与免疫纳米金联接，制备了传感元件。该传感元件对甲硝唑、替硝唑、地美硝有良好的响应，交叉反应率达90％以上，可测定0.001-100mg/L浓度范围内的甲硝唑、替硝唑、地美硝唑及其代谢物，检测限约为0.0019mg/L，回收率约为90％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及电化学
，尤其涉及一种基于免疫金的电化学传感元件的制备 方法及其应用。
技术介绍
硝基咪唑类抗生素包括甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、异丙硝唑等，是畜 禽饲料中常用的抗原虫感染及抗菌药，并具有促生长作用，还能与其他抗生素联合使用于 治疗厌氧菌感染。但是该类药物及其某些代谢物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和 遗传毒性，被许多国家列为违禁药物。在欧盟，洛硝哒、地美硝唑和甲硝唑分别在1993年、 1995年和1998年被禁止用于食用动物，2002年美国食品与药物管理局公布了禁止在进口 动物源性食品中使用的11种药物，其中包括地美硝唑及其他硝基咪唑类药物。我国农业 部和国家药品监督管理局第227号公告规定甲硝唑、地美硝唑及其盐、酯及制剂不准以促 进动物生长为目的在所有食品动物饲养过程中使用。 目前在国内，测定硝基咪唑类兽药的方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱联用 法、高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法等。但是这些方法的检测设备昂贵、样品前 处理复杂，同时还需要较高水平的专业人员进行操作，很难满足对批量样品进行快速检测 和现场检测的要求。 近年来，由于免疫传感器技术具有分析速度快、可信度高、适合样品初级筛选检测 等优点，许多学者研宄纷纷研宄农药、兽药和抗生素等小分子的免疫传感器检测方法，具有 灵敏度高、检测费用低、灵活快捷等优点，其关键技术是抗体固定，即把抗体固定在电极上 制备高灵敏的电化学免疫传感元件。
技术实现思路
甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑、异丙硝唑等都具有相类似的咪唑结构（1、2、 3位上取代基不同），本专利技术针以甲硝唑的醇基为连接臂，合作半抗原和免疫原、包被原，制 备抗体，同时发挥纳米材料表面积大的优势，制备免疫金，且与备金-巯基丙酸单分子膜联 接，制备一种高灵敏的硝基咪唑类药物残留电化学传感元件，为抗生类药物残留的快速检 测和现场检测提供支撑。 本专利技术采用如下技术方案： 本专利技术的基于免疫金的电化学传感元件的制备方法的具体步骤如下： (1)用0· lmol/L NaOH和0· lmol/L HNO3分别淋洗金电极三次，每次lmin，再置于 新鲜配制的piranha溶液，浸泡30min ; (2)取出金电极，超纯水淋洗lmin，置于超纯水中超声清洗3min，无水乙醇中超声 清洗3min，重复3次； (3)依次用〇· 3 μ m和0· 05 μ mAl203粉末抛光至呈镜面后，金电极置于piranha溶 液，浸泡30min，重复步骤（2)，然后用高纯氮吹干金电极表面； (4)把金电极浸于三巯基丙酸溶液中温育12h，依次用超纯水、无水乙醇淋洗三 次，每次lmin，然后用高纯氮吹干金电极表面，即为MPA/金电极，然后将金电极浸于碳二亚 胺盐酸盐溶液和N-羟基硫代琥珀亚胺溶液的混合液中12h后，用超纯水淋洗3min，再将金 电极浸于含有免疫金的磷酸缓冲液中，4°C过夜，最后用超纯水清洗，高纯氮吹干金电极表 面，即为免疫金/MPA/金电极。 步骤（1)和步骤（3)中，所述的piranha溶液是由30wt %的H2O2和浓硫酸组成， 两者的体积比为1:3。 步骤⑷中，所述的三巯基丙酸溶液的浓度为0. lmol/L。 步骤⑷中，所述的碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基硫代琥珀亚胺溶液的浓度均为 0· lmol/L，混合液中两者的体积比为1:1〇 步骤⑷中，所述的磷酸缓冲液的pH为7. 4。 步骤（4)中，所述的免疫金的制备方法如下： (a)胶体金的制备 将所用器皿用酸液浸泡72h，取出，自来水冲洗，蒸馏水浸泡24h,干燥，用含5wt% 的二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，硅化完成后用双蒸水冲洗，烘干，取质量浓度 0. 01%氯金酸水溶液IOOmL加热至沸，300rpm搅拌下加入预热的质量浓度1%柠檬酸三钠 水溶液4mL，金黄色的氯金酸水溶液在2min内变为灰色，然后由灰色变为酒红色，继续搅拌 煮沸，直至溶液呈透亮的红色，冷却后用双蒸水定容至100mL，4°C冰箱中避光保存； (b)免疫金的制备 将步骤（a)制备的胶体金和硝基咪唑抗体溶液分别以0.1 Mol/L 1(20)3调pH至 9. 0,电磁搅拌硝基咪唑抗体溶液溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌lOmin，加入5wt % BSA使 溶液终浓度为lwt%，以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀，用15000r/min离心30min， 轻吸上清液，沉淀用含Iwt % PEG的PBS缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心，如此洗涤2~4 次，以彻底除去未结合的蛋白质，最终用含lwt% PEG的PBS缓冲液悬浮并保存。 步骤（b)中，所述的PBS缓冲液的量为0· 01M，pH为7. 4。 步骤（b)中，所述的硝基咪唑抗体的制备方法如下： (1)硝基咪唑半抗原MNZ-SA的合成 在IOmL烧杯中加入甲硝挫0· 85g、琥?白酸酐I. 25g、无水吡啶lmL，在磁力搅拌器 上搅拌反应4h，可得乳白色液体，将混合物置微波炉内加热约IOs至混合物刚好沸腾，混 合物变成透明的黄色液体，旋转蒸发仪减压除去吡啶得白色固体，加入20mL蒸馏水超声溶 解，用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用旋转蒸发仪减压浓缩至干，加入5mL乙酸乙 酯超声溶解后，加入25mL石油醚，静置，减压抽滤得白色固体粉末，即为硝基咪唑半抗原 MNZ-SA，真空干燥，放入冰箱中保存备用； (2)硝基咪唑免疫原BSA-MNZ 用电子天平准确称取0· 1084g步骤（1)制备的半抗原溶于5mL N，K -二甲基甲 酰胺中，加入31〇11^00：，放在摇床上搅拌1〇1^11，加入20.〇1^順5，混合液室温避光在摇床 上反应3. 5h，观察到有白色的沉淀物，用离心机进行离心，取上层清液逐滴加到0. lmol/L， pH8. 0的磷酸缓冲液配置的40mL BSA溶液中，室温避光在摇床上反应2h，用0. 9wt %的生理 盐水透析3天，每天换液3次，冷冻干燥即得甲硝唑全抗原白色固体粉末； (3)硝基咪唑抗体的制备 选取两只新西兰大白兔，背部皮下多点注射500 μ g BSA-MNZ，其中BSA-MNZ用生 理盐水稀释，加等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，在15d，再次注射相同剂量经不完全弗氏 佐剂充分乳化的免疫原，29d、39d和49d，注射250 μ g经不完全弗氏佐剂充分乳化的免疫 原，59d后，耳静脉取血，测定抗体效价，效价合适后，心脏完全取血，分离及纯化抗血清，得 到硝基咪唑抗体。 本专利技术的方法制备的传感元件可以用于检测动物性食品中硝基咪唑类药物残留。 本专利技术的积极效果如下： 本专利技术根据硝基咪唑类抗生素的结构特点，设计和制备了通用的硝基咪唑类结构 半抗原，并采用活化酯法，将硝基咪唑半抗原与载体蛋白（BSA和0VA)偶联制备免疫原和包 被原，其结构得到核磁共振图谱、红外图谱和紫外图谱的鉴定，偶联分子摩尔比分别为11:1 和10:1。同时制备了硝基咪唑抗体，效价为1:100000,制备免疫纳米金；利用单分子膜自组 装技术在金电极上形成单分子膜，再通过DCC和NHS与免疫纳米金联接，制备了传感元件。 建立了硝基咪唑类药物电化学传感检测技术，对甲硝挫、替硝挫、地美硝有良好的响应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于免疫金的电化学传感元件的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：(1)用0.1mol/L NaOH和0.1mol/L HNO3分别淋洗金电极三次，每次1min，再置于新鲜配制的piranha溶液，浸泡30min；(2)取出金电极，超纯水淋洗1min，置于超纯水中超声清洗3min，无水乙醇中超声清洗3min，重复3次；(3)依次用0.3μm和0.05μmAl2O3粉末抛光至呈镜面后，金电极置于piranha溶液，浸泡30min，重复步骤(2)，然后用高纯氮吹干金电极表面；(4)把金电极浸于三巯基丙酸溶液中温育12h，依次用超纯水、无水乙醇淋洗三次，每次1min，然后用高纯氮吹干金电极表面，即为MPA/金电极，然后将金电极浸于碳二亚胺盐酸盐溶液和N‑羟基硫代琥珀亚胺溶液的混合液中12h后，用超纯水淋洗3min，再将金电极浸于含有免疫金的磷酸缓冲液中，4℃过夜，最后用超纯水清洗，高纯氮吹干金电极表面，即为免疫金/MPA/金电极。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘家荣，帅瑞琦，方豪，冯依璠，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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