本发明专利技术公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与胃癌早期病理演变有密切相关miRNA-200c的方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法可在RNA水平上检测miRNA-200c表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期RNA水平筛查，同时，本发明专利技术的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与胃癌病理演变mRNA表达改变 (病理演变过程）的相关检测技术。
技术介绍
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近 210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400 多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌 症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万)，700多万患 者，每年的花费是1. 4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消 耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要 改变，本专利技术的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做 到基因水平癌症的治未病。 2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对 1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率 没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性(多态性);2.肿瘤 细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学）等。同时，该报告中亦提 出应重新审视现有诊治癌症的措施。 本专利技术人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的 早期诊断。依照现有的临床医学影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术）指标来诊断癌症，都是肿瘤 形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释 放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这 一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度 来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相 当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病理演变 过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官 生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位 克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以 2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶时，同时发 现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌 症死亡率不降的真正原因。 随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为 了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能 在基因的一级转录功能产物（mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在癌 变前期或癌细胞形成(单克隆）前，就可以做到早期预测和筛查。 微小核醣核酸（microRNA/miRNA)是一段长度约为22核苷酸的寡核醣核酸分子， 它们可以藉由调控mRNA来抑制转译作用或是造成mRNA的降解来降低基因的表现。近来有 许多研究发现，miRNA与癌症具有高度的相关性。因此推论miRNA可能是癌化过程的一个 导因。到目前为止，在人体上有超过700个miRNA被发现，而大约有100左右的miRNA被 确认与人类癌症具有相关性，这其中包含有食道癌、乳癌、血癌、肺癌、脑癌、肝癌、直肠结肠 癌、胶质细胞瘤、垂体瘤等多种肿瘤在食道癌细胞中，miR-17-92家族等microRNA在多种肿 瘤中表达上调。种miR-21在成胶质细胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、 胃癌等多恶性肿瘤中上调表达。 虽然肿瘤组织microRNA表达谱与肿瘤发病及预后相关，但是检测技术复杂、创伤 大，难以真正应用于临床诊断。相比较而言，外周血血清较易获得和检测，临床应用便捷，利 于推广。血清中是否存在血清microRNA的表达谱与对应肿瘤组织microRNA表达谱关联？ 2008年至今已报道多项血清microRNA与肿瘤关系的研究工作，为血清microRNA作为分子 标记应用于肿瘤的早期诊断和预后提供了工作基础。 microRNA在血清中可长期稳定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反复冻融、酸碱环境、长期 保存等各种处理方法均不会造成血清microRNA的损失。血清microRNA的来源尚无定论， 现在普遍认为其来源于组织细胞的主动分泌过程。成熟的microRNA在细胞内被脂质或 脂蛋白包被成外切酶体（Exosome)，分泌至胞外并进入血液；进入血液的外切酶体可经内 吞作用进入受体细胞并去包被，释放出microRNA发挥生物学功能。外切酶体介导的细胞 间microRNA的交换，是细胞通讯的一种新的途径，对维持内环境的稳态有重要作用血清 microRNA作为肿瘤诊断和预后的标志物，主要有以下优点：检测的损伤小、稳定性好、灵敏 度高，可应用于早期肿瘤的检测。但是，由于血清中microRNA的表达量较低，寻找一种灵敏 度高、操作简便且成本低廉的检测方法是目前血清microRNA应用于肿瘤临床检测亟待解 决的问题。microRNA是一类高度保守的非编码小RNA，主要通过结合靶基因mRNA的5pUTR、 编码区或3pUTR而在转录后水平上对基因的表达行负调控功能，microRNA参与基因表达调 控的方式主要是抑制翻译过程的进行，少数情况下也可引起mRNA降解，生物信息学分析表 明，每个microRNA可能调节数百个祀基因，提示microRNA可能参与调节细胞生命活动中众 多的信号转导途径，在细胞增殖、分化、凋亡、免疫反应及血管生成等一系列过程中发挥作 用，miR-16-l，miR-143，miR-145等可因p53，p68与Drosha复合物相互作用而表达上调，从 而抑制细胞增殖。microRNA表达异常会严重影响细胞信号转导途径的功效，导致细胞增殖 和分化失去控制，最终导致肿瘤的发生。miRNA_200c是肿瘤抑制基因，在胃癌患者细胞中被发现，在其他癌症表达降低。之 后的研究表明，miRNA-200c是一个抑癌功能的miRNA。 本专利技术选择多组临床标本(癌 症病人、高危人群、正常对照)采用核酸原位杂交技术和免疫组化方法对miRNA-200c与胃癌 的早期预警进行检测分析。 本专利技术人在研究中发现miRNA-200c在胃癌患者、癌症高危人群、正常对照人有明 显的表达量变化，将miRNA-200c作为早期筛查胃癌变前期有非常重要的临床诊断意义。 miRNA-200c在胃癌变前期过程中低表达。他作于癌变前期筛查、及胃癌治疗后的复发、转移 预警也有非常重要的临床意义。 专利技术人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床 诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治已 病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，专利技术 人在开发和生产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：裘建英，张玉丽，张云福，裘霖，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。