本发明专利技术涉及一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达载体的构建及应用。该方法是利用序列如SEQ ID NO.1和2的引物，以SNV毒株为模板，进行PCR扩增得REV病毒LTR线性化载体。此发明专利技术不仅可用于研究REV或其它反转录病毒的复制、转译、致病等机制；而且能实现对外源基因的快速克隆、高效表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达载体的构建及 应用。此专利技术不仅可用于研宄REV或其它反转录病毒的复制、转译、致病等机制；而且能实 现对外源基因的快速克隆、高效表达。
技术介绍
禽网状内皮组织增生症病毒（REV)主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的 一组综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增 生性疾病。REV感染鸡群往往生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；并引起感染鸡的免疫抑制， 干扰其它禽病疫苗的免疫效应，导致免疫失败。REV前病毒基因组结构具有完整的反转录 病毒基因组结构，包括5'LTR-gag-pol-env-LTR3'基本结构。其中，LTR为非编码长末端重 复序列，与病毒复制、转译密切相关；且被证明具有真核启动子和增强子活性。5'LTR不但 具有RNA聚合酶II启动子功能，还具有增强子及转录调控原件。3'LTR除了具有PolyA终 止转录功能外，也具有启动子特性。因此，有效利用LTR中序列成分，不但可以研宄REV病 毒复制、转译、致病等机制，而且可构建表达载体，用于外源基因表达及运输。在传统表达载 体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体， 实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低 下。因此，开发不依赖于限制性内切酶的基于REVLTR的线性化真核表达载体可简化克隆 过程，实现基因快速克隆表达。
技术实现思路
1、要解决的技术问题 本专利技术的目的是在于提供一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的线性真核 表达载体的构建及应用方法，用于外源基因的快速克隆与表达。本专利技术的原理和最核心的 关键技术是科学地设计扩增出含REV病毒LTR的线性化载体以及外源基因片段，利用商品 化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆，随后转化到大肠杆 菌进行质粒扩增与鉴定；并将阳性克隆转染真核细胞实现基因高效表达。 所述引物如下： a,PCR扩增REV病毒LTR线性化载体引物：上游引物：5 'ccaacagagatggataccctaggtcaatg3'； 下游引物：5 'agacggaagacactggaggcaaaaggctc3' ； b，PCR扩增外源基因引物： 上游引物：5 'cagtgtcttccgtctATGNNNNNNNNNNNNNNN3' ； 下游引物：5 'atccatctctgttggCTANNNNNNNNNNNNNNN3' ； 本专利技术公开了PCR扩增REV病毒LTR线性化载体引物以及PCR扩增外源基因用于 体外快速重组克隆引物的保守序列。本专利技术还公开了一种基于REV病毒LTR的外源基因快 速克隆表达的方法，其特征在于用重组酶ExnaseTM II，将线性化的REV病毒LTR载体与外 源基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆转化到大肠杆菌。 2、技术方案 1)设计扩增含REV病毒LTR的线性化载体以及外源基因片段引物：扩增含REV病 毒LTR的线性化载体上游引物位于SNV毒株前病毒基因组7783-7811位；扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物位于SNV毒株前病毒基因组974-1002位；扩增外源基因的上游 引物中除了ATG起始密码子，外源基因特异的15个碱基N外，均带有15个保守的与扩增含 REV病毒LTR的线性化载体下游引物互补的碱基；扩增外源基因的下游引物中除了终止子， 外源基因特异的15个碱基N外，均带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性化载体 上游引物互补的碱基。具体引物序列见附表1，由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技 公司合成。 2)基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用：以含REV病毒前病毒 全基因组质粒SNV以及外源基因为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含REV病毒LTR的 真核表达线性化载体REV-LTR以及外源基因片段（附图1，步骤1);并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆（附图1，步骤2);阳性克隆即可进行真核细胞转染、表达鉴定（附图 1，步骤3)。 3、有益效果 该专利技术设计的引物以及构建的基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体，不仅对 研宄反转录病毒复制、转译、致病等分子机制具有重要意义；而且可实现对外源基因的快速 克隆高效表达，具有潜在的应用价值。本专利技术中整合了基于重组酶ExnaseTM II的快速克 隆策略。该克隆方法不依赖于限制性内切酶以及连接酶，大大简化了外源基因的克隆过程， 提高了效率。通过单轮PCR及重组即可成功获得在REV病毒LTR调控下的外源基因高效真 核表达载体。【附图说明】 图1基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用策略 步骤1:以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及外源基因为模版，利用表1中 引物，PCR分别扩增出含REV病毒LTR的真核表达线性化载体REV-LTR以及外源基因片段； 步骤2 :利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；步骤3 :阳性克隆转染真核细胞、表达 鉴定。 图2电泳分析PCR产物 泳道1，扩增出的基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体；泳道2,扩增出的eGFP 片段。 图3eGFP在基于REV病毒LTR的真核表达载体中的表达 A.转染REV-LTR-eGFP的DF1细胞，B.未转染正常DF1细胞。【具体实施方式】 为更好的理解本专利技术的内容，以下实施方式结合附图给出了基于REV病毒LTR的 真核表达线性化载体的构建及应用的示例。 实施例 1)设计扩增含REV病毒LTR的线性化载体以及EGFP片段引物：扩增含REV病毒 LTR的线性化载体上游引物位于SNV毒株前病毒基因组7783-7811位；扩增含REV病毒LTR 的线性化载体下游引物位于SNV毒株前病毒基因组974-1002位；扩增EGFP片段的上游引 物中除了eGFP片段特异的18个碱基外，还带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性 化载体下游引物互补的碱基；扩增eGFP片段的下游引物中除了EGFP片段特异的18个碱基 N外，还带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性化载体上游引物互补的碱基。具体 引物序列见附表1，由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技公司合成。 2)基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体以及EGFP片段PCR扩增：以含REV 病毒前病毒全基因组质粒SNV以及pcDNA3. 1-EGFP为模版，表1所述引物为引物进行 PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40yl水，5yl10倍缓冲液，lyl 10mMdNTP，lyllOymol上游引物，lyllOymol下游引物，lyl10ng/yl的SNV以及 pcDNA3. 1-EGFP，1y1 商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。PCR扩增反应循环参 数为：95°C变性3分钟，随后进行30个循环（95°C变性10秒，57°C退火30秒，72°C延伸3 分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。如 图2所示，其中泳道M表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达线性化载体的制备方法，其特征在于，利用下述引物，以SNV毒株为模板，进行PCR扩增得REV病毒LTR线性化载体；上游引物：5‘ccaacagagatggataccctaggtcaatg3’；下游引物：5‘agacggaagacactggaggcaaaaggctc3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，田晓彦，范中雷，秦爱建，邵红霞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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