PEG修饰的甲基对硫磷水解酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一类PEG修饰甲基对硫磷水解酶及其作为农药降解剂的应用。该PEG修饰甲基对硫磷水解酶制备的主要步骤为：将甲基对硫磷水解酶置于适当的缓冲液体系中，调节pH值，加入PEG修饰剂，4℃-37℃恒温状态下进行修饰反应，结合不同的纯化方法，比较不同修饰度产品的活性和稳定性特点，并进行组合。其优点在于，组合后的PEG修饰甲基对硫磷水解酶作为农药降解剂活性和稳定性可控，且降低成本。此类农药降解剂可以浓缩液添加剂、崩解片或干粉形式，用于清洗水果和蔬菜表面残留农药、在农产品加工或中药原材料加工过程去除残留农药、或者土壤修复等多个方面，保障食品安全、服务民生。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一类PEG修饰甲基对硫磷水解酶及其作为农 药降解剂的应用。该PEG修饰甲基对硫磷水解酶制备的主要步骤为：将甲基对硫磷水解酶 置于适当的缓冲液体系中，调节pH值，加入PEG修饰剂，4°C-37°C恒温状态下进行修饰反 应，结合不同的纯化方法，比较不同修饰度产品的活性和稳定性特点，并进行组合。其优点 在于，组合后的PEG修饰甲基对硫磷水解酶作为农药降解剂活性和稳定性可控，且降低成 本。此类农药降解剂可以浓缩液添加剂、崩解片或干粉形式，用于清洗水果和蔬菜表面残 留农药、在农产品加工或中药原材料、茶叶加工过程去除残留农药、或者土壤修复等多个方 面，保障食品安全、服务民生。 技术背景 聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG)是由很多重复的氧乙烯基（-CH2-CH2-〇-) 结构单元组成的线形或带支链的中性惰性大分子聚合物，其CAS登记号为25322-68-3,化 学结构如下所不。 HO- (CH2-CH2-〇) ^i-CH^CH^OH 通过化学衍生，将聚乙二醇与蛋白共价结合后，具有显著的稳定蛋白质、延长蛋白 类产品活性时间的作用。具体原理如下：（1)PEG在水溶液中会发生水合作用，每个氧化乙 烷单元（-CH2-CH2-〇_)能紧紧结合2-3个水分子。PEG的这种水合作用还会随着其分子量 的增大而升高，当分子量的继续升高时，PEG链在溶液中会发生自折叠，形成较多类似蛋白 质或多肽二级结构的折叠链段，这些PEG链段通过相互作用还会松散地结合本体溶液中游 离的水分子。因而，PEG较其他高分子化合物表现出更大的流体力学体积。这种性质是蛋 白质，尤其是药用蛋白质分子经聚乙二醇修饰后其体内循环半寿期得到显著延长的一个重 要的物理基础。（2)PEG的这种水合性质在溶液中还表现出较大的空间稳定效应。这种立体 效应具体表现在弹性作用方面。在较稀的溶液中，当另一大分子物质接近PEG修饰的蛋白 质表面时，由于PEG链段的运动受到束缚，造成构象熵的丢失产生弹性排斥力从而将大分 子推开。这些力使溶液中其他分子很难与PEG修饰的大分子充分发生碰撞接触，从而赋予 了PEG修饰制品的低蛋白吸附与抗蛋白酶酶解的性质。PEG这种独特的性质还被用来沉淀 和纯化蛋白质、核酸和病毒等。（3)PEG分子的链段柔顺性是其良好性质的另一重要物理基 础。相对于靠近聚乙二醇的大分子如蛋白质来说，PEG在与其接触的过程中利用良好的链 柔顺性有效的保护了大分子生物活性。PEG表面各位点间结合能的差别较小，外来蛋白质不 能优先选择PEG的某一位点固定吸附；同时，PEG良好的片段柔顺性使其不断改变构象以适 应蛋白质的表面拓扑学结构，有效防止了蛋白质的变性。 PEG有两个活性羟基，为避免在蛋白质修饰的过程中发生交联反应，人们经常选 用一端被甲基封闭的聚合物即单甲氧基聚乙二醇（monomethoxylpolyethyleneglycol,mPEG)对蛋白质进行化学修饰。但是mPEG的末端为羟基，反应活性较弱，在温和的条件下不 能修饰在蛋白质的氨基酸残基上。所以应首先对mPEG的末端羟基进行衍生化处理，将羟基 活化成亲电活性较高的官能团，使之能在温和的条件下能与蛋白质或多肽的氨基、巯基或 其它亲核基团发生反应，而不损伤其生物学活性。先后出现的聚乙二醇的化学衍生方式主 要有尿酰氯基（cyanuricchloride,trichloro-s-triazine)活化、磺酸酯基活化、氨基活 化、肼基活化、巯基活化、羧基及其琥珀酰亚氨酯活化、琥珀酰亚氨基碳酸酯（succinimidyl carbonate)活化、醒基活化和环氧基活化等。其中， ?巯基活化 在修饰化学中，巯基是一种十分活泼的功能基。Zalipsky等首先报道了一种巯基 聚乙二醇的详细制备程序，其转化率在80-95%之间，其反应化学方程式如下。在这个反应 中，反应体系中氧含量的控制最为关键。相同条件下，体系中氧含量越低，反应的转化率就 越大。Harris等曾报道了几种巯基聚乙二醇的制备方法。但无论采用哪种合成路线，都会 有副反应发生，生成通过二硫键连接的副产物（mPEG-S-)2。副产物可以用一些常见的还原 剂如硼氢化钠、四氢铝锂等将副产物还原为目标产物。【主权项】1. 一类PEG修饰甲基对硫磷水解酶的制备方法，主要步骤为： 非特异氨基修饰：将甲基对硫磷水解酶加入缓冲液I进行溶解，调节pH至7-9,加 入聚乙二醇修饰剂，蛋白和聚乙二醇修饰剂摩尔比为1 : 5-1 : 50。所述缓冲液I为 0? 02-0. 2mol/LTris-Cl或磷酸盐缓冲液（PB)，pH7-9,恒温状态下，4°C-37°C进行修饰； N端氨基修饰：将甲基对硫磷水解酶加入缓冲液II进行溶解，调节pH至4-6,加入聚 乙二醇修饰剂，蛋白和修饰剂摩尔比为1 : 1-1 : 10;所述缓冲液II为0.02-0. 2mol/L NaAc-HAc或磷酸盐缓冲液，pH4-6,恒温状态下，4°C-37°C进行修饰； 或，巯基修饰：将甲基对硫磷水解酶加入缓冲液III进行溶解，调节pH至7-9,加入聚 乙二醇修饰剂，蛋白和修饰剂摩尔比为1 : 1-1 : 10;所述缓冲液III为0.02-0. 2mol/L Tris-Cl或硼酸-硼砂缓冲液，pH7-9,恒温状态下，4°C-37°C进行修饰。 所述PEG修饰甲基对硫磷水解酶的方法中，非特异氨基修饰所用的聚乙二醇修饰 剂为mPEG-SC5000、mPEG-SC10000、mPEG-SC20000 ;N端氨基修饰所用聚乙二醇修饰剂为 mPEG-ALD5000、mPEG-ALD10000、mPEG-ALD20000 ;或，巯基修饰所用的聚乙二醇修饰剂为 mPEG-MAL5000、mPEG-MAL10000、mPEG-MAL20000。2. 根据权利要求1所述PEG修饰甲基对硫磷水解酶的制备方法，其中，修饰时间为 3-24小时。3. 根据权利要求1所述PEG修饰甲基对硫磷水解酶的制备方法，其中，修饰后的蛋白 采用疏水层析、离子交换层析和凝胶过滤层析组合的方法进行不同修饰度产物纯化，层析 柱为丁基疏水层析柱ButylSepharose6FF、阴阳离子交换层析柱CM/DEAESepharose6FF 和Hiloadsuperdex20016 / 60prepgrade层析柱，流动相为 0.05-0. 2mol/LTris-HCl 或磷酸盐缓冲液或0.02-0. 2mol/LNaAc-HAc，pH4-9,添加0-3M硫酸铵或者0-1. 5M氯化 钠。4. 根据权利要求3所述不同修饰度PEG修饰甲基对硫磷水解酶的纯化方法，其中，依据 不同修饰度的PEG修饰甲基对硫磷水解酶的活性和稳定性结果进行组合，不同组分分别起 到短期迅速起效和长效保持的作用。5. 根据权利要求4中的不同修饰度PEG修饰甲基对硫磷水解酶组合制成的农药降解 齐U，其特征在于活性和稳定性可控，且成本降低。此类农药降解剂可以浓缩液添加剂、崩解 片或干粉形式，用于清洗水果和蔬菜表面残留农药、在农产品加工或中药原材料、茶叶加工 过程去除残留农药、或者土壤修复等多个方面。【专利摘要】本专利技术公开了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类PEG修饰甲基对硫磷水解酶的制备方法，主要步骤为：非特异氨基修饰：将甲基对硫磷水解酶加入缓冲液I进行溶解，调节pH至7‑9，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和聚乙二醇修饰剂摩尔比为1∶5‑1∶50。所述缓冲液I为0.02‑0.2mol／LTris‑Cl或磷酸盐缓冲液(PB)，pH7‑9，恒温状态下，4℃‑37℃进行修饰；N端氨基修饰：将甲基对硫磷水解酶加入缓冲液II进行溶解，调节pH至4‑6，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和修饰剂摩尔比为1∶1‑1∶10；所述缓冲液II为0.02‑0.2mol／L NaAc‑HAc或磷酸盐缓冲液，pH4‑6，恒温状态下，4℃‑37℃进行修饰；或，巯基修饰：将甲基对硫磷水解酶加入缓冲液III进行溶解，调节pH至7‑9，加入聚乙二醇修饰剂，蛋白和修饰剂摩尔比为1∶1‑1∶10；所述缓冲液III为0.02‑0.2mol／L Tris‑Cl或硼酸‑硼砂缓冲液，pH7‑9，恒温状态下，4℃‑37℃进行修饰。所述PEG修饰甲基对硫磷水解酶的方法中，非特异氨基修饰所用的聚乙二醇修饰剂为mPEG‑SC5000、mPEG‑SC10000、mPEG‑SC20000；N端氨基修饰所用聚乙二醇修饰剂为mPEG‑ALD5000、mPEG‑ALD10000、mPEG‑ALD20000；或，巯基修饰所用的聚乙二醇修饰剂为mPEG‑MAL5000、mPEG‑MAL10000、mPEG‑MAL20000。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑春杨，肖桂鹏，张先恩，张治平，王殿冰，王琳，
申请(专利权)人：北京百川飞虹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11