MSP纳米微孔和相关方法技术

本文中提供了耻垢分枝杆菌孔蛋白纳米孔、包含此类纳米孔的系统以及使用和产生此类纳米孔的方法。此类纳米孔可以是野生型MspA孔蛋白、突变MspA孔蛋白、野生型MspA旁系同源物孔蛋白、野生型MspA同系物孔蛋白、突变MspA旁系同源物孔蛋白、突变MspA同系物孔蛋白或单链Msp孔蛋白。还提供了能够诱导型表达Msp孔蛋白的细菌菌株。

【技术实现步骤摘要】
本申请是申请日为2009年9月22日、专利技术名称为“MSP纳米微孔和相关方法”的中国专利技术专利申请200980142855.5的分案申请。交叉参考相关申请本申请要求2008年9月22日提交的美国临时申请系列案61/098,938的权益，所述临时申请系列案以其全文通过引用合并入本文。政府许可权利的声明本专利技术是利用在由国立卫生研究院授予的基金号5R21HG004145下的政府资助进行的。政府在本专利技术中具有某些权利。背景已建立的DNA测序技术需要大量DNA和若干冗长的步骤来仅构建全长序列的数十个碱基。然后必须以“鸟枪法”方式(非线性地依赖于基因组的大小和依赖于从其构建全长基因组的片段的长度的工作)装配该信息。这些步骤很昂贵且费时，尤其当测定哺乳动物基因组的序列时。概述本文中提供了包括对具有界定通道(tunnel)的前厅(vestibule)和缢缩区(constriction zone)的耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)孔蛋白施加电场的方法，其中Msp孔蛋白位于第一导电液体介质与第二导电液体介质之间。还提供了改进通过Msp孔蛋白的通道(tunnel)的电导的方法，包括除去、添加或置换野生型Msp孔蛋白的前厅或缢缩区中的至少一个氨基酸。还提供了包括具有界定通道的前厅和缢缩区的Msp孔蛋白的系统，其中所述通道位于第一液体介质与第二液体介质之间，其中至少一种液体介质包含分析物，以及其中系统对于检测分析物的性质是有效的。还提供了包括具有界定通道的前厅和缢缩区的Msp孔蛋白的系统，其中所述通道位于第一液体介质与第二液体介质之间的脂双层中，并且其中第一与第二液体介质之间的液体连通的唯一点存在于通道中。还提供了突变的Msp孔蛋白。例如，提供了突变的耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)，其包含界定通道的前厅和缢缩区，以及至少第一突变MspA单体，所述单体包含位置93上的突变和位置90、位置91或位置90及91上的突变。还提供了突变的MspA孔蛋白，其包含具有约2至约6nm的长度和约2至约6nm的直径的前厅，和具有约0.3至约3nm的长度和约0.3至约3nm的直径的缢缩区，其中所述前厅和缢缩区一起界定了通道，以及还包含至少第一突变MspA旁系同源物或(paralog)同系物(homolog)单体。还提供了突变MspA旁系同源物或同系物，其包含具有约2至约6nm的长度和约2至约6nm的直径的前厅，和具有约0.3至约3nm的长度和约0.3至约3nm的直径的缢缩区，其中所述前厅和缢缩区一起界定了通道。描述了产生突变的Msp孔蛋白的方法。例如，本文中提供了产生突变的MspA孔蛋白的方法，包括在位置93上和位置90、位置91或位置90及91上修饰野生型MspA单体。还提供了产生具有界定了通道的前厅和缢缩区的突变MspA孔蛋白的方法，包括在野生型MspA旁系同源物或同系物单体的前厅或缢缩区中缺失、添加或置换任何氨基酸以便所得的突变MspA孔蛋白能够在施加电场后将分析物转位通过通道。还提供了一种方法，所述方法包括在不使用电场的情况下使分析物转位通过耻垢分枝杆菌孔蛋白(Msp)孔蛋白的通道。本文中提供了核酸序列。任选地，核酸序列可包含第一和第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列编码第一Msp单体序列并且第二核苷酸序列编码第二Msp单体序列。该核酸序列还可包含编码氨基酸连接体序列的第三核苷酸序列。任选地，该核酸序列还包含编码第三或更多Msp单体序列的第三或更多核苷酸序列。例如，所述核酸序列还可包含第3、第4、第5、第6、第7和第8核苷酸序列。所述第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8核苷酸序列编码第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8Msp单体序列，并且该核酸序列还包含编码氨基酸连接体序列的第9核苷酸序列。还提供了包含两个或更多个单链Msp的Msp孔蛋白。还提供了由本文中所述的核酸编码的多肽。还提供了包含本文中描述的多肽的载体。还提供了用本文中描述的任何载体转染的培养细胞或其后代，其中所述细胞能够表达Msp孔蛋白或Msp孔蛋白单体。还提供了包含本文中描述的任何载体的耻垢分枝杆菌菌株。还提供了能够诱导Msp单体表达的突变的细菌菌株，所述细菌菌株包含：(a)野生型MspA的缺失；(b)野生型MspC的缺失；(c)野生型MspD的缺失；和(d)包含有效地连接于Msp单体核酸序列的诱导型启动子的载体。还提供了产生单链Msp孔蛋白的方法，所述方法包括：(a)用包含能够编码单链Msp孔蛋白的核酸序列的载体转化突变的细菌菌株；和任选地(b)从所述细菌纯化单链Msp孔蛋白。该突变的菌株可包含野生型MspA、野生型MspB、野生型MspC和野生型MspD的缺失，以及包含有效地连接于Msp核酸序列的诱导型启动子的载体。可用包含能够编码单链Msp孔蛋白的核酸序列的载体转化该突变的菌株。还提供了使用Mps孔蛋白例如单链Msp孔蛋白的方法。例如，所述方法可包括产生具有第一侧面和第二侧面的脂双层，向脂双层的第一侧面加入Msp孔蛋白例如纯化的单链Msp孔蛋白，对双分子层的第二侧面施加正电位，使实验性核酸序列或多肽序列转位通过Msp孔蛋白，测量使序列转位通过Msp孔蛋白的阻塞电流，以及将该实验性阻塞电流与阻塞电流标准相比较，确定该实验性序列。附图概述上述方面和许多附带的有利方面将变得更容易理解，因为当与下列附图结合，参考下列详述，上述方面和许多附带的有利方面可得到更好地理解。图1显示野生型MspA(WTMspA)孔蛋白的结构和电荷分布。在pH 8时，预期酸性残基主要带负电荷并且碱性残基主要带正电荷。突变的位置和残基由箭头和标记指示。参见Faller等人，Science，303:1189(2004)。图2显示WTMspA、突变体D90N/D91N/D93N(M1MspA，也称为M1-NNN)和突变体D90N/D91N/D93N/D118R/E139K/D134R(M2MspA，也称为M2-NNN)孔蛋白的通道形成活性和单通道电导的测定结果。左图显示当MspA孔蛋白存在于水浴双分子层的溶液(1M KCl，20℃)中时，双分子层的电导随时间的变化。电导的逐步增加被解释为MspA孔蛋白至双分子层内的插入。右边是这些电导步长(conductance本文档来自技高网...

【技术保护点】
耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，其包含界定通道的前厅和缢缩区，其中所述Msp包含突变MspA，其中与野生型Msp的缢缩区相比，从所述Msp的缢缩区内除去了负电荷，并且其中所述Msp包含带正电荷的氨基酸取代野生型Msp的缢缩区内存在的带负电荷的氨基酸。

【技术特征摘要】
2008.09.22 US 61/098,9381.耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，其
包含界定通道的前厅和缢缩区，其中所述Msp包含突变MspA，其中
与野生型Msp的缢缩区相比，从所述Msp的缢缩区内除去了负电荷，
并且其中所述Msp包含带正电荷的氨基酸取代野生型Msp的缢缩区
内存在的带负电荷的氨基酸。
2.权利要求1的Msp，其中所述突变MspA包含位置90、91
和93处的突变。
3.权利要求1的Msp，其中所述突变MspA包含位置90、91
和93处的突变，其中位置90处的突变是D90N，位置91处的突变是
D91N，并且位置93处的突变是D93N。
4.权利要求3的Msp，其中包含位置118处的突变，其中位置
118处的突变是D118R。
5.权利要求4的Msp，其中包含位置139处的突变，其中位置
139处的突变是E139K或E139R。
6.权利要求5的Msp，其中包含位置118、139和134处的突
变，其中位置118处的突变是D118R，位置134处的突变是D134R，
并且位置139处的突变是E139K。
7.权利要求3的Msp，其中突变MspA包含位置126处的突变，
其中位置126处的突变是Q126R。
8.权利要求1的Msp，其中所述突变MspA包含位置88处的

\t突变。
9.权利要求1的Msp，其中所述突变MspA包含位置90、91
和93处的突变，其中位置90处的突变是D90Q，位置91处的突变是
D91Q，并且位置93处的突变是D93N。
10.权利要求9的Msp，其中包含位置118、139和134处的突
变，其中位置118处的突变是D118R，位置134处的突变是D134R，
并且位置139处的突变是E139K。
11.权利要求1的Msp，其中所述突变MspA包含带正电荷的氨
基酸取代野生型Msp的入口处存在的带负电荷的氨基酸。
12.耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，其
包含界定通道的前厅和缢缩区，其中所述Msp包含突变MspA，所述
突变MspA包含位置90、91和93处的突变，其中位置90处的突变
是D90N，位置91处的突变是D91N，并且位置93处的突变是D93N。
13.耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)孔蛋白(Msp)，其
包含界定通道的前厅和缢缩区，其中所述Msp包含突变MspA，所述
突变MspA包含位置90、91和93处的突变，其中位置90处的突变
是D90Q，位置91处的突变是D91Q，并且位置93处的突变是D93N。
14.权利要求13的Msp，其中包含位置118、139和134处的突
变，其中位置118处的突变是D118R，...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·H·贡德拉赫，M·尼德韦斯，T·Z·巴特勒，M·帕夫伦科，M·A·特罗尔，S·斯库马兰，
申请(专利权)人：华盛顿大学，UAB研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US