本发明专利技术涉及动物遗传学和动物分子细胞生物学，提供了一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体，为进一步研究该基因在细胞中的功能及其作用机理提供了必要的工具和手段。该基因在机体多个器官都有表达，对于调节机体代谢起到了重要的调节作用。研究该基因在特定组织或细胞类型中的功能和调控代谢途径，通过构建真核表达载体使其在特定条件下过量表达是一种必不可少的技术手段，构建牛MEN1基因(以下称bMEN1)的高效真核细胞表达载体将来可用于牛各组织器官机体代谢疾病提供必要的前期研究、甚至为人疾病的治疗提供模式型研究的重要工具和研究手段。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物遗传学和动物分子细胞生物学，提供了一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体。
技术介绍
牛MEN1基因与人或小鼠的MEN1高度同源，其编码蛋白与人或小鼠menin的同源性分别高达98.69％和96.73％。人或小鼠的研究成果暗示牛的MEN1/menin在调节牛(奶牛)机体正常代谢中的重要调节作用，推测其异常表达与牛的代谢紊乱疾病(酮病、酸中毒、脂肪肝等)的发作有密切关系。人menin蛋白是多发性内分泌肿瘤1型(multiple endocrine neoplasia type 1，MEN1)基因的表达产物，编码610个氨基酸，是一个呈多组织性表达的核蛋白。其致病关键基因MEN1基因是位于人染色体11q13位点，人MEN1基因于1997年首次鉴定与克隆。人MEN1是一种以甲状旁腺、胰岛和垂体前叶肿瘤等内分泌器官肿瘤为特征的家族性常染色体显性疾病，通常又称wermer综合症。MEN1基因敲除小鼠模型由于引发了严重的发育障碍，包括神经系统、心脏、肝脏等重要器官的发育缺陷，在胚胎期11-13天死亡，提示MEN1基因在细胞生长和发育过程中的关键作用。另一方面，MEN1基因杂合缺失小鼠模型可以存活，但后期也发现了与人类相类似的甲状旁腺肿瘤，并表现出类似于人类MEN1综合症的症状，提示menin在发病过程中的关键抑制作用。近年来的研究表明，menin表达异常与白血病、糖尿病、(非酒精性)脂肪肝等疾病也密切相关。同时，MEN1引发的癌变器官通常是激素分泌的重要器官，如胰岛β细胞分泌胰岛素、垂体前叶分泌催乳素等，因而更突显menin在调控机体正常发育、平衡稳态的机体代谢过程中的重要功能。目前证实，menin可参与基因组蛋白表观遗传学修饰进而影响下游基因的转录、还可与基因组蛋白质互作调节基因组的稳定性、参与调节细胞周期的调控因子而调控细胞的分裂增殖。许多研究者已经开始展望将menin/MEN1用于一些疾病的治疗。当然，在此之前，还需要进行大量的研究和多方的论证。要研究menin在各种生理及病理活动中的作用，或是将其用于治疗，都需要能够在真核细胞中大量表达menin。研究过程中，高表达menin的细胞环境可以使研究者体外探索揭示menin可调控的具体生物学活性和功能，为将menin在病理细胞中过表达用于疾病的治疗提供必要的研究基础。目前国内对MEN1的研究，多还停留在讨论MEN1基因多态性与肿瘤发生发展的关系，或者是某一段MEN1基因对细胞的影响，受研究材料的限制，还没有研究者深入探讨MEN1基因对细胞生物学影响的具体机制。
技术实现思路
本专利技术提供了一种可高效表达牛menin蛋白的真核表达载体，为进一步研究该基因细胞中的功能及其作用机理提供了必要的工具和手段。该基因在机体多个器官都有表达，对于调节机体代谢起到了重要的调节作用。研究该基因在特定组织或细胞类型中的功能和调控代谢途径，通过构建真核表达载体使其在特定条件下过量表达是一种必不可少的技术手段，构建牛MEN1基因(以下称bMEN1)的高效真核细胞表达载体可为将来用于牛各组织器官机体代谢疾病提供必要的前期研究、甚至为人疾病的治疗提供模式型研究的重要工具和研究手段。本专利技术所提供的可高效表达牛menin蛋白的真核表达载体具体为pcDNA3.1-mycHis(-)A/bMEN，其中插入的MEN1基因片段其核苷酸序列如Seq ID No:8所示；专利技术人在本专利技术中所采用具体方法是首先获得牛野生型全长MEN1基因，之后将其构建进入pcDNA3.1-mycHis(-)A中，形成重组质粒，最后在真核细胞表达融合型menin蛋白；更为具体的步骤如下：1、牛野生型全长MEN1基因cDNA的获得：采集处于泌乳中期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织，立即冻存于液氮中，之后用Trizol(Invetrogen，US.)提取总RNA，Superstcript III试剂盒(Invitrogen，US.)合成cDNA；根据Genebank中公布的bMEN1基因完整mRNA序列(NM_001076161.2)设计引物，并在上游引物的5’端分别加上保护碱基g、EcoRI的酶切识别位点和kozak序列gccacc，获得全新的上游引物序列如下(5’-ggaattcgccaccatggggctgaaggctgcccagaaaacg-3’，其核苷酸序列如Seq ID No:1所示)、下游引物加上保护碱基cg和HindIII的酶切识别位点，获得全新的下游引物序列如下(5’-cgaagctttcagagacccttgcgctgccgcttgag-3’，其核苷酸序列如Seq ID No:2所示)；PCR条件如下：以上述合成的cDNA为模板，在高保真pfu酶(KP201-01，TIANGEN)的作用下，经94℃5min预变性，94℃45sec，54℃50sec，72℃2min，经过35个循环，72℃10min总延伸，扩增出的目的条带长度为1851bp，其核苷酸序列如Seq ID No:3所示；2、MEN1基因的酶切上步RT-PCR扩增得到的bMEN1基因片段分别进行EcoRI和HindIIII的单酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳纯化并回收(DP209，TIANGEN)后可用于与酶切后的pcDNA3.1-mycHis(-)A载体的连接反应；3、pcDNA3.1-mycHis(-)A质粒的提取、酶切提取质粒后，进行EcoRI和HindIIII的双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用回收试剂盒进行大片段的回收，并存于-20℃备用；4、连接酶切后的MEN1基因片段和pcDNA3.1-mycHis(-)A载体片段以8-10∶1摩尔比例混合，建立T4DNA连接酶(Promega，US.)的连接反应(20μL体系)，在16℃连接过夜；5、转化10μL连接产物转化200μL大肠杆菌DH5α感受态细胞，取300ul转化产物涂布于含有终浓度为100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养16-18小时后，将单个菌落挑出，加入含100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基，37℃摇床中培养16小时后提取质粒，即为本专利技术的目标产物：重组基因bMEN1的表达载体：pcDNA3.1-mycHis(-)A/bMEN。将最终获得的重组基因表达载体pcDNA3.1-mycHis(-)A/bMEN1分别转染牛的乳腺上皮细胞MAC-T、体外表达系统中最常用的仓鼠卵巢细胞CHO、用于体外研究肌肉生长发育的小鼠成肌细胞C2C12，24h小时后可分别检测到ME本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体，其特征在于：具体为pcDNA3.1‑mycHis(‑)A/bMEN，其中插入的MEN1基因片段其核苷酸序列如Seq ID No:8所示。
【技术特征摘要】
1.一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体，其特征在于：具体为
pcDNA3.1-mycHis(-)A/bMEN，其中插入的MEN1基因片段其核苷酸序列如Seq ID No:8所示。
2.一种可在真核细胞高效表达牛menin的表达载体的获得方法，其特征在于：
具体的步骤如下：
(1)、牛野生型全长MEN1基因cDNA的获得：
采集处于泌乳中期的中国荷斯坦奶牛乳腺组织，立即冻存于液氮中，之后用Trizol提
取总RNA，Superstcript III试剂盒合成cDNA；
根据Genebank中公布的bMEN1基因完整mRNA序列设计引物，并在上游引物的5’端分
别加上保护碱基g、EcoRI的酶切识别位点和kozak序列gccacc，获得全新的上游引物序列，
其核苷酸序列如Seq ID No:1所示、下游引物加上保护碱基cg和HindIII的酶切识别位点，
获得全新的下游引物序列，其核苷酸序列如Seq ID No:2所示；
PCR条件如下：
以上述合成的cDNA为模板，在高保真pfu酶的作用下，经94℃5min预变性，94℃45sec，
54℃50sec，72℃2min，经过35个循环，72℃10min总延伸，扩增出的目的条带长度为1851bp，
其核苷酸序列如Seq ID No:3所示；
【专利技术属性】
技术研发人员：师科荣，刘学，王中华，李洪辉，杜红霞，岳书俭，殷彬，林雪彦，侯秋玲，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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