利用Cryptococcus thermophilus生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工程技术领域。本发明专利技术采用Cryptococcus thermophilus在液态发酵条件下生产SOD，为胞外酶。耐热SOD产量最高可达2000U/ml，本发明专利技术具有良好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】Cryptococcus thermoph i I us生产耐热超氧化物歧化酶(SOD)的方法
利用Cryptococcus thermophilus生产超氧化物歧化酶(SOD)，属于生物工程
本专利技术涉及利用菌株Cryptococcus thermophilus保藏号为DSM19443，通过液态发酵获得耐高温SOD。
技术介绍
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)具有良好的防御氧毒性的作用，能够增强机体抗辐射损伤的能力。近年来，它已经成为治疗炎症、肿瘤和自身免疫疾病的新型抗炎药物；化妆品和食品行业中用于防晒、防皮肤衰老和抗炎的添加剂以及用于某些疾病探针的生化试剂。SOD广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。当前，SOD主要从动物血液(如猪血或者牛血)中提取(袁烨.超氧化物歧化酶的制备方法.申请号，02147888.0, 2002-12-19 ;徐文中，阎家麒.超氧化物歧化酶大规模生产新工艺.申请号，01144922.5，2001-12-24)，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响。由于动物、植物特别是动物血液来源困难，而微生物可以人工培养，有利于实现工业化生产。根据目前报道，已经可以通过微生物发酵法生产S0D，但主要为胞内酶(刁治民，姚银霞，张文静.酵母菌SOD发酵条件的研宄.青海师范大学学报(自然科学版)，2002，4:48-51 ;杨明琰，郭爱莲，沈俭，等.高产SOD酵母菌的诱变选育及发酵条件研宄.食品科学，2005，26(10): 147-150)，提取工艺较为繁琐。天然SOD热稳定性较差，在加工和使用过程中容易受热失活。如何有效地解决SOD在高温工艺条件下酶活力的稳定问题，如何使含SOD的产品在生产工艺流程中不用顾忌高温是高效利用SOD的关键。利用生物工程生产新一代高稳定性、高耐热性的SOD是当前SOD开发最重要的途径。本专利技术米用Cryptococcus thermophilus 生产 S0D，Cryptococcus thermophilus是一种耐热菌，可以产生耐高温的S0D，采用该菌发酵生产SOD具有发酵周期短，发酵液中SOD活力较高，且能耐高温，开发前景广阔。
技术实现思路
目前能够产生SOD的菌株比较少，主要为一些酵母，且为胞内酶，需要破壁后才能提取分离，操作成本高，不利于大规模生产制备。本专利技术的目的是针对当前问题，利用菌株Cryptococcus thermophilus保藏号为DSM 19443，通过液态发酵获得胞外耐热S0D。本专利技术的技术方案如下:液态发酵培养基组成是碳源0.5-100g/l，氮源0.5-100g/l, K2HP04l-4g/l, MgS047H200.1-0.5g/l，NaCl l_2g/l。在一定体积的发酵罐内装入发酵体积60-70% (v/v)的培养基，灭菌冷却后接入Cryptococcus thermophilus，接种量为1-10 %，起始pH和发酵过程pH均为自然，发酵温度为20-45°C，发酵周期为2_6天。最终发酵液中SOD活力最高可达2000U/ml。本专利技术所有种子培养基配方与发酵培养基相同。将斜面菌种接种到装有种子培养基的三角瓶后，种子的培养时间为48小时，种子的培养温度为45°C。菌种保存用斜面培养基配方为:葡萄糖20g/l，MgS047H200.2g/l，酵母膏g/1，琼脂20g/l，pH 自然。SOD活的测定方法是基于SOD抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用。SOD活力测定方法和 SOD 活力定义详见:Chin_Wen Lin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su, Theextract1n and properties of superoxide dismutase from porcine blood Chin-ffenLin, Jeng-Huh Yang and Lieh-Chi Su，Meat Science，1997，46(3):303-312.本专利技术有如下特征:(I)Cryptococcus thermophilus用于SOD发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖、鹿糖、乳糖、半乳糖。氮源可以是(NH4) 2S04、NH4CKNH4NO3, NaN03、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、玉米浆、黄豆饼粉。(2) Cryptococcus thermophilus发酵SOD采用的发酵罐体积为5-50L。搅拌转速为70-150r/min，通风量1:0.1-1:0.5v/v/m。结合本领域的基本常识可根据生产情况调整发酵罐大小。本专利技术的有益效果:首次采用Cryptococcus thermophilus进行了 SOD的发酵，不仅酶活高，而且生产的SOD具有良好的耐热效果，该方法适合工业化大规模生产耐热S0D，不仅解决当前SOD不耐热的缺点，而且提供了大量的SOD来源。【具体实施方式】实施例1将斜面菌种接种到装有50ml培养基的250ml三角瓶中，培养基组成为:葡萄糖20g/l，牛肉膏 10g/l，蛋白胨 10g/l，NH4NO31g/!，玉米浆粉 12g/l，pH 自然。45°C，发酵 72小时。发酵结束后，将50ml发酵液10000转/min离心，去除菌体。上清粗酶液用于测定酶的PH及温度参数。取上清粗酶液0.5ml，分别置于pH 4，5，6，7，8的柠檬酸一磷酸缓冲液3.5ml 中，在 55°C下测定 SOD 活力分别为 1600，1700，2000，1700，1500U/ml。因此该 SOD 的最适反应pH是6。分别取上清粗酶液0.5ml,与3.5ml pH 6的柠檬酸一磷酸盐缓冲液混合，在 25，35，45，55，65°C 下分别测得酶活为 1500，1600，2000，2000，1500U/ml，因此该酶的最适温度为45-55°C ο分别取上清粗酶液0.5ml，与3.5ml pH 6的柠檬酸一磷酸盐缓冲液混合，在25，35，45，55，65，75°C下保温48小时，然后测定酶活分别为2000，2000，2000，2000，1800，1700U/ml，结果表明该酶具有良好的耐热性。不同pH的柠檬酸-磷酸盐缓冲液的配制方法参见:诸葛健，工业微生物实验技术手册，中国轻工业出版社，1994。实施例2将斜面菌种接种到装有50ml的种子培养基的250ml三角瓶中，种子培养基组成为:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨10g/l，NH4NO31g/!，玉米浆粉12g/l，pH自然，121灭菌20min，摇床转速150转/分钟，45°C下培养48小时。该过程有10个相同的三角瓶，共得到500ml种子液。将500ml种子液接种入50L发酵罐，发酵培养基组成为:葡萄糖20g/l，牛肉膏10g/l，蛋白胨3g/l，NH4NO31g/!，玉米浆粉6g/l，pH自然，发酵温度为45°C，装液量70%，通风量为1:1.5v/v/mo发酵时间为3天。在该条件下，发酵液中最终SOD活力为1500U/ml。实施例3将培养好的IL种子液接种到1L发酵罐中。种子及发酵培养基组成均为:果糖30g/l，牛肉本文档来自技高网...
【技术保护点】
本专利技术利用Cryptococcus thermophilus通过液态发酵生产耐热的超氧化物歧化酶(SOD)。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁彦蕊，牟兆琳，饶榕，王雪芹，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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