一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体技术

本发明专利技术公开了一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体，该方法包括：构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点；针对该位点设计定点突变引物，以谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，获得定点突变文库；从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。该方法通过拉氏图提供的结构信息对酶进行理性设计，并结合定点突变技术，有效提高突变概率，节省时间，提高实验效率，并筛选得到催化活力优于野生型酶的突变酶，该突变酶可提高催化L-谷氨酸或其钠盐生成γ-氨基丁酸的反应速率，有利于GABA的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧 酶突变体的方法及其突变体。
技术介绍
定点突变（site-directedmutagenesis或site-specificmutagenesis)是指在 目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对变化的技术，是重组DNA进化的基础，该方法 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研宄某个（些）氨 基酸残基对蛋白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件 特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。特别是在酶的理性设计中，或者利用随即 突变等定向进化技术筛选得到具有潜力的重要氨基酸残基位点后，进行定点突变分析，将 有利于更好的了解该位点在蛋白质结构和功能的关系中所发挥的作用。谷氨酸脱羧酶（glutamatedecarboxylase，简称GAD;EOi. 1. 1. 15)是一种广泛地 存在于植物、动物和微生物中的氨基酸脱羧酶，它可以专一地催化L-谷氨酸的a-羧基脱 羧反应生成y-氨基丁酸（y-aminobutyricacid，简称GABA)。GABA是哺乳动物中枢神经 系统的一种关键的抑制性神经递质，具有抑制中枢神经系统过度兴奋、解除神经紧张等生 理功能。GABA对人体具有镇静安神、促进睡眠、健脑益智、降低血压、改善免疫功能、延缓衰 老等作用，是一种在食品和医药领域具有广泛应用的天然氨基酸，已被国家卫生部批准为 "新资源食品"。 目前，利用谷氨酸脱羧酶或具有该酶活力的细胞进行GABA的高效生物合成正得 到越来越多的重视。在工业生产中，往往希望提高反应速率，从而提高生物催化与转化的效 率。GAD作为制备和生产GABA的关键酶，提高其催化活性有利于其在大规模生物反应器中 的应用。 中国专利ZL200510049189. 4和中国专利ZL200510049187. 5公开了一种生产 氨基丁酸的短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306,对该菌株的GAD基因进 行克隆，构建重组质粒，转化到大肠杆菌（Escherichiacoli)BL21(DE3)中，可实现该基因 的可溶表达。但是，该基因表达的GAD比活力不高，不利于该酶在GABA生物制备中的应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种利用拉氏图信息制备谷氨酸脱羧酶突变体的方法及其突变体， 该方法可有效提高突变的概率，节省时间，提高实验效率，采用该方法获得的突变体具有较 高的酶活，可显著提高反应速率。 -种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，包括： (1)构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从 拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点； (2)针对所述处于构象不合理区的氨基酸残基位点设计定点突变引物，以谷氨酸 脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变文库； (3)从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。 其中，具体地，构建谷氨酸脱羧酶三维结构模型的程序为MODELLER和Swiss Model;进行二面角合理性评价的程序为PROCHECK。 该方法通过MODELLER和SwissModel两个程序构建谷氨酸脱羧酶的三维结构 模型，再利用PR0CHECK程序进行该酶的二面角合理性评价，生成拉氏图（Ramachandran Plot)，拉氏图中的每个区域的颜色从深到浅排列的次序依次为最佳合理区、额外合理区、 一般合理区和不合理区，从不合理区中找到构象不合理的氨基酸残基位点。 具体地，所述谷氨酸脱羧酶为短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306 的谷氨酸脱羧酶GAD1407。该谷氨酸脱羧酶GAD1407在拉氏图中处于构象不合理区的氨基 酸残基位点为413位点，该位点的氨基酸为赖氨酸。 本专利技术采用上述方法得到了一个谷氨酸脱羧酶突变体，该突变体的氨基酸序列如 SEQIDNO. 2所示。该突变体的编码基因的碱基序列如SEQIDNO. 1所示。 本专利技术通过对谷氨酸脱羧酶GAD1407基因中对应413氨基酸残基位点的碱基进行 定点突变将原编码赖氨酸的碱基序列AAA替换为ATT，编码的氨基酸为异亮氨酸，获得PCR 扩增片段，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变的菌株文库，然后，将该文库中的菌株进 行谷氨酸脱羧酶的表达与纯化，获得的突变酶分别置于20°C和55°C条件下处理，将55°C处 理后的比活力对比20°C处理后的比活力，得到残余活力比值，将突变酶的该比值与野生型 酶的残余活力比值进行比较筛选出活力高的突变酶，即谷氨酸脱羧酶突变体K413I。 本专利技术还提供了一种包含所述编码基因的谷氨酸脱羧酶表达单元、重组质粒以及 转化子。 表达单元的启动子可以为常用的17启动子、lac启动子或araBAD启动子。在这 些启动子的作用下，谷氨酸脱羧酶的突变酶可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶 表达。 本专利技术还提供了所述谷氨酸脱羧酶突变体在催化L-谷氨酸或其钠盐生成Y-氨 基丁酸中的应用。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果： 本专利技术方法通过拉氏图提供的结构信息对酶进行理性设计，并结合定点突变技 术，有效提高突变概率，节省时间，提高实验效率，并筛选得到催化活力优于野生型酶的突 变酶，该突变酶的比活力是野生型酶的1. 6倍，可提高催化L-谷氨酸或其钠盐生成Y-氨 基丁酸的反应速率，有利于GABA的工业化生产，利于广泛推广。【附图说明】 图1为质粒pET28a(+)_gad的基因图谱； 图2为MODELLER(左）和SwissModel(右）模建结果的拉氏图； 图3为突变位点K413在GAD三级结构中的位置图（以球表示）； 图4为定点突变原理不意图； 图5为野生型GAD酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱； 图6为突变酶和野生型GAD在pH4. 8条件下的比活力。【具体实施方式】 为进一步说明本专利技术，结合以下实例进行具体说明： 本专利技术研宄的基础是来自短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306中 的GAD基因。其中短乳杆菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306已在中国专利申请 200510049189. 4和中国专利申请200510049187. 5中公开，由浙江大学保藏在中国普通微 生物保藏管理中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院）。本申请使用的菌株由浙江大 学馈赠。 表达宿主菌E.coliBL21 (DE3)为浙江大学生物工程研宄所保藏； pET28a(+)-GAD1407重组质粒由浙江大学保存；FastDigestDpnI限制酶、EasyPfu DNA聚合酶购自FermentasInternationalInc.Canada;FastPfuDNA聚合酶、Ni-NTA agarose层析介质购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂 盒、DNAMarker、异丙基-0-D-硫代半乳糖苷（IPTG)购自生工生物工程（上海）股份有限 公司。种子培养基为LB培养基，表达培养基为TB培养基，均含有50yg/mL卡那霉素。 本专利技术通过M本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷氨酸脱羧酶突变体的制备方法，其特征在于，包括：(1)构建谷氨酸脱羧酶的三维结构模型，进行二面角合理性评价，生成拉氏图，从拉氏图中确定处于构象不合理区的氨基酸残基位点；(2)针对所述处于构象不合理区的氨基酸残基位点设计定点突变引物，以谷氨酸脱羧酶基因为模板，进行定点PCR扩增，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；(3)从所述定点突变文库中筛选谷氨酸脱羧酶突变体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梅乐和，柯丕余，黄俊，胡升，赵伟睿，吕长江，
申请(专利权)人：浙江大学宁波理工学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33