本发明专利技术涉及用于氧输送的组合物及方法。H-NOX蛋白被突变为显示出改善的或优化的血液气体O2输送动力学和热力学性质。工程H-NOX蛋白包含突变，所述突变相对于对应的野生型H-NOX结构域赋予改变的O2或NO配体-结合，并可作为生理相容的哺乳动物血液O2气体载体起作用。本发明专利技术也提供了药物组合物、试剂盒及方法，它们使用野生型或突变H-NOX蛋白，用于治疗输送O2对其有益的任何病症。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请日为2007年5月21日、申请号为200780027798. 7、题为"用于氧输送的 组合物及方法"的专利申请的分案申请。 相关申请的交叉引用 本申请要求 2006 年 5 月 22 日由 Michael A. Marietta、Stephen P. L. Cary、 Elizabeth M. Boon 和 Jonathan A. Winger 提交的题目为 "Engineering H-NOX Proteins for Therapeutic Nitric Oxide and Oxygen Delivery" 的美国临时申请序列号 60/921,505(美国案件号B06-084)的权益。该美国临时申请于2007年5月1日从2006年 5月22日提交的美国实用申请序列号11/440, 588转化为临时申请，其公开内容通过引用被 各自由此并入。 关于联邦资助研宄或开发的声明 本研宄由资金号DE-AC03-76SF资助。美国政府在授予本申请的任何专利中可能 具有权利。
本申请涉及H-NOX蛋白和使用它们输送氧的方法。H-NOX蛋白提供了一种新的治 疗工具，用于向人类输送O 2，并用于兽医的目的向动物输送〇2。 专利技术背景 当前的血库系统具有内在的风险和严重的局限性。血液分型错误、免疫原性、细菌 试剂的传播、和诸如Hiv-I和肝炎的病毒感染将威胁生命的危险摆在输血患者的面前。此 外，受限的供血者可用性、对特殊血型的需求、红细胞短暂的保存期、和对冷冻的需要都限 制了患者输血的可达性。稳定的血液代用品的开发能消除目前血库系统的风险，并在大多 数情况下提高患者输血的可用性。因此，向器官和组织输送氧气（O 2)以缓解由于失血或缺 氧引起的症状是主要的治疗目标。 在美国，没有基于血红蛋白的疗法被批准用于人类。潜在的疗法包括多种人 工 O2载体（由 Spahn，D.R.等人（2005)，"Artificial 02carriers:status in 2005，" Curr. Pharm. Des. 11(31) :4099-4114综述），例如工程改造的血红蛋白（例如，美国专利号 6, 022, 849)。然而，一些潜在的血液代用品，如基于血红蛋白的血液代用品，由于它们与一 氧化氮（NO)的反应性而受限。具体而言，NO在体内多种重要过程的调控中作为化学信使 发挥作用，包括神经传导、炎症、血小板凝集和胃肠及血管平滑肌紧张度的调节。NO直接与 结合到血红蛋白的O 2反应，形成高铁血红蛋白和硝酸盐。血红素铁和NO都通过结合的氧 原子被氧化，并且反应发生地如此迅速以至于没有观察到〇 2被NO代替（参见，例如美国专 利号 6, 455, 676)。 由于NO被持续地产生并消耗，体内有天然的NO周转（turnover)。当给予无细胞 的血红蛋白时，NO产生与消耗之间的平衡通过与无细胞的血红蛋白的反应而被改变。NO与 结合到血红蛋白的O 2之间的氧化反应是不可逆的，导致N0、0 2和血红蛋白的破坏。因为亚 硝酰血红蛋白解离的半衰期是5-6小时，NO结合到没有O2结合的血红蛋白在生理时标中是 有效不可逆的，由此有效失活作为无细胞O2载体的血红蛋白。 -旦NO分子与血红蛋白反应，它被从信号分子库中消除，由此引起某些不利状 况。例如，NO与血红蛋白（有或没有O 2结合）的结合可以阻止血管舒张并潜在地导致高血 压，这有时在某些细胞外血红蛋白溶液给药后被观察到。 介导某些炎症反应也需要N0。例如，由内皮产生的NO抑制血小板凝集。结果，由 于NO被无细胞的血红蛋白（具有或没有O 2结合）结合，血小板凝集可能增加。随着血小板 凝集，它们释放有效的血管收缩化合物，如血栓烷AjP血清素。这些化合物可与由血红蛋白 清除引起的降低的NO水平协同起作用，以产生显著的血管收缩。除了抑制血小板凝集，NO 也抑制中性粒细胞（neutrophil)附着于细胞壁，该附着反过来可导致细胞壁损伤。内皮细 胞壁损伤已经在某些血红细胞溶液输注中观察到。 基于血红蛋白的血液代用品的另一个主要缺点是它们对O2的尚亲和性。该尚亲 和性限制了血红蛋白在期望的位置（如外周组织）以临床有用的速率释放氧气的能力。可 选地，在到达微血管床之前由主动脉中较低亲和性的基于血红蛋白的血液代用品引起的O 2 释放可能由于高氧性血管收缩反应而引起血管收缩（Winslow假设）。此外，基于血红蛋白 的血液代用品受到无细胞的血红蛋白从血浆中快速清除的限制，所述清除是由于从血浆中 清除无细胞的血红蛋白的血红蛋白受体的存在所致。无细胞的血红蛋白也可能引起肾脏中 毒，可能是由于肾小球中的NO耗尽，引起收缩和后续的机能障碍。 由于目前血液代用品的局限性和捐献血液的长期缺乏，仍对其它或替代性的用于 输送氧的疗法存在显著的兴趣和需要。具体而言，具有较低NO反应性和/或较长的血浆保 留时间的血液代用品是期望的。也需要O2结合解离常数或解离速率（off rate)适合于具 体临床或工业应用的氧载体。其中〇2载体是期望的示例性工业应用包括细胞在培养基中 的生长，这通常被到达细胞的〇 2量限制。 专利技术概述 本专利技术部分基于这样惊人的发现：野生型和突变H-NOX蛋白具有比血红蛋白低得 多的NO反应性，并因此是理想的O 2载体。如果希望，突变可以被引入H-NOX蛋白，以改变 它们对〇2和NO配体的结合，以进一步优化H-NOX蛋白作为0 2载体的应用。 一方面，本专利技术以突变H-NOX蛋白为特征。因此，在一些实施方式中，本专利技术提供 了具有至少一个突变的分离的H-NOX蛋白，与相应野生型H-NOX蛋白的O 2解离常数或NO反 应性比较，所述突变改变了 O2解离常数或NO反应性。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白 的〇2解离常数在血红蛋白的〇 2解离常数的2个数量级之内，并且突变H-NOX蛋白的NO反 应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的O 2解离 常数在20°C下在约2nM到约50 μ M之间，在20 °C下在约50nM到约10 μ M之间，在20°C下 在约20nM到约2 μΜ之间，在20°C下在约IOOnM到约1. 9 μΜ之间，在20°C下在约150nM到 约1 μΜ之间，或者在20°C下在约IOOnM到约255nM之间。在一些实施方式中，突变H-NOX 蛋白的O2解离常数在20°C下小于约80nM，例如在20°C下在约20nM到约75nM之间。在一 些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少100倍，例如， 比血红蛋白的NO反应性低至少1000倍。在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白的NO反应性 在 20°C下小于约 700s-1，例如，在 20°C下小于约 600s'500s'400s'300s'200s'100s' 75s \50s \25s \20s \l0s \50s \3s \2s \l. 8s \l. 5s \l. 2s \l. Os \〇. 8s \〇. 7s 1 或0· 6s'在一些实施方式中，突变H-NOX蛋白对氧的kQff(k解离）在20°C下在约0· Ol到约 20084之间，例如本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种药物组合物，其包含(i)药学上可接受量的H‑NOX蛋白，其中所述H‑NOX蛋白的O2解离常数在血红蛋白的O2解离常数的2个数量级之内，并且其中所述H‑NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍，和(ii)药学上可接受的载体。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S·P·L·卡瑞，E·M·博恩，E·魏纳特，J·A·温格，M·A·马莱塔，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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