本发明专利技术公开了一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法及试剂盒，方法包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测。试剂盒包括：核酸提取试剂、PCR反应试剂、RNase-free水以及引物和探针。设计的引物包括野生纯合型上游引物、野生纯合型下游引物、野生纯合型探针、敲除纯合型上游引物、敲除纯合型下游引物以及敲除纯合型探针。本发明专利技术的方法可在1h内完成基因型检测，而且成本较低，操作简单。本发明专利技术的方法结果准确、易判断，且还具有较高的灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法及试剂盒。
技术介绍
基因敲除技术是通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点，目前已成为一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法。基因敲除小鼠则是利用基因敲除技术使正常实验小鼠的基因组特定位点上的目的基因失活，经过繁殖筛选后所得到的目的基因表达的缺陷小鼠，是研究被敲除的目的基因的理想实验材料。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选再到动物模型的建立等各方面都得到了较大发展。载脂蛋白M（Apolipoprotein M，ApoM）是由Xu 和 Dahlback等在1999年在餐后血浆富甘油三酯脂蛋白中发现的。载脂蛋白M 作为新近被发现的载脂蛋白，其在脂蛋白代谢中具有重要的生理功能。研究表明，胰岛素、瘦素、雌激素、高血糖以及许多细胞因子都可调节载脂蛋白M的表达，载脂蛋白M也可能与肥胖、糖尿病及胎儿的生长发育等疾病的发生发展有关，但其作用机制尚不明确。 载脂蛋白M基因定位于人6号染色体上主要组织相容复合物（MHC-Ⅲ）的高保守区域，编码一个约26kDa的蛋白。研究表明，载脂蛋白M主要参与前β-HDL的形成，对HDL代谢有重要的调节作用。因此，载脂蛋白M在调节脂质代谢，特别是在胆固醇的逆转运中以及在预防动脉粥样硬化方面起着重要作用。因此，载脂蛋白M基因敲除小鼠常用作疾病研究的动物模型。但是，基因敲除动物在用于研究前必须进行准确、及时的基因型检测，而建立快速可靠的检测方法尤其重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于解决上述问题，提供一种经济、快速、准确以及灵敏度较高的检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法。本专利技术的另一目的在于解决上述问题，提供一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的试剂盒。 实现本专利技术目的之一的技术方案是：一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测；设计的引物和探针序列如下：野生纯合型上游引物：5’-CGGAAGTGGACATACCGATTG-3’；野生纯合型下游引物：5’-AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3’；野生纯合型探针：5’-FAM-CTGAAGGTTGGTTCCCACCAGCCC-BHQ-1-3’；敲除纯合型上游引物：5’-GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3’；敲除纯合型下游引物：5’-CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’；敲除纯合型探针：5’-CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3’。实时荧光定量PCR反应体系如下：DNA模板2μL；野生纯合型上游引物（100μM）0.1μL；野生纯合型下游引物（100μM）0.1μL；野生纯合型探针（100μM）0.1μL；敲除纯合型上游引物（100μM）0.1μL；敲除纯合型下游引物（100μM）0.1μL；敲除纯合型探针（100μM）0.1μL；Taq热启动酶（5U/μL）0.125μL；dNTP Mixture（2.5mM）2μL；10×PCR缓冲液2.5μL；RNase-free水补足体积至25μL。实时荧光定量PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃ 10s，60℃ 10s，40个循环；40℃ 30s。实现本专利技术另一目的的技术方案是：一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR反应试剂、RNase-free水以及引物和探针；所述引物和探针序列如下：野生纯合型上游引物：5’-CGGAAGTGGACATACCGATTG-3’；野生纯合型下游引物：5’-AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3’；野生纯合型探针：5’-FAM-CTGAAGGTTGGTTCCCACCAGCCC-BHQ-1-3’；敲除纯合型上游引物：5’-GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3’；敲除纯合型下游引物：5’-CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’；敲除纯合型探针：5’-CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3’。PCR反应试剂包括10×PCR缓冲液、dNTP Mixture以及Taq热启动酶。本专利技术具有的积极效果：1）本专利技术的方法可在1h内完成基因型检测，而且成本较低，操作简单。（2）本专利技术的方法结果准确、易判断，且还具有较高的灵敏度。附图说明图1为野生纯合型小鼠PCR产物测序序列图。图2为敲除纯合型小鼠PCR产物测序序列图。图3为野生纯合型小鼠灵敏度检测示意图，图中：横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，曲线1～6依次为4×106、4×105、4×104、4×103、4×102、4×101copies/μL。图4为敲除纯合型小鼠灵敏度检测示意图，图中：横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，曲线1～6依次为4×106、4×105、4×104、4×103、4×102、4×101copies/μL。具体实施方式1、材料与方法。1.1、标本来源：采用基因敲除技术将C57BL/6小鼠载脂蛋白M基因的第2外显子至第5外显子的核酸片段用外源性载体序列Lox-Neo-LoxP替换掉，成功获得了可稳定遗传的载脂蛋白M基因敲除杂合型小鼠（以下均简称为敲除杂合型小鼠），通过繁殖可获得载脂蛋白M基因敲除纯合型小鼠（以下均简称为敲除纯合型小鼠）。经过饲养繁殖，敲除杂合型小鼠和敲除纯合型小鼠均能正常生长繁殖，且毛色、进食、活动、体温和质量等方面均与（未进行基因敲出的）野生纯合型小鼠无明显差异。1.2、主要试剂及仪器：Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒【生工生物工程（上海）股份有限公司】，Taq热启动酶、dNTP Mixture、10×PCR 缓冲液【TaKaRa公司】，Light Cycler 480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪【Roche公司】。1.3、设计并合成引物和探针：引物和探针的设计是整个检测方法的关键。根据NCBI数据库中小鼠载脂蛋白M基因序列以及Lox-Neo-LoxP序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物和探针。其中，野生纯合型小鼠探针5’末端标记荧光基团6-羧基荧光素（FAM），敲除纯合型小鼠探针5’末端标记荧光基团3H-吲哚菁染料（CY5）。具体序列如下：野生纯合型上游引物：5’-CGGAAGTGGACATACCGATTG-3’；野生纯合型下游引物：5’-AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3’；野生纯合型探针：5’-FAM-CTGAAGGTTGGTTCCCACCAGCCC-BHQ-1-3’；敲除纯合型上游引物：5’-GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3’；敲除纯合型下游引物：5’-CG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测；其特征在于：设计的引物和探针序列如下：野生纯合型上游引物：5’‑CGGAAGTGGACATACCGATTG‑3’；野生纯合型下游引物：5’‑AAACGGCTAAGGGAGACGAGA‑3’；野生纯合型探针：5’‑FAM‑CTGAAGGTTGGTTCCCACCAGCCC‑BHQ‑1‑3’；敲除纯合型上游引物：5’‑GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC‑3’；敲除纯合型下游引物：5’‑CGATGTTTCGCTTGGTGGTC‑3’；敲除纯合型探针：5’‑CY5‑TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT‑BHQ‑2‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，包括：设计并合成引物和探针；提取小鼠的DNA；实时荧光定量PCR检测；
其特征在于：设计的引物和探针序列如下：
野生纯合型上游引物：5’-CGGAAGTGGACATACCGATTG-3’；
野生纯合型下游引物：5’-AAACGGCTAAGGGAGACGAGA-3’；
野生纯合型探针：5’-FAM-CTGAAGGTTGGTTCCCACCAGCCC-BHQ-1-3’；
敲除纯合型上游引物：5’-GCTCCTGCCGAGAAAGTATCC-3’；
敲除纯合型下游引物：5’-CGATGTTTCGCTTGGTGGTC-3’；
敲除纯合型探针：5’-CY5-TGCAATGCGGCGGCTGCATACGCT-BHQ-2-3’。
2.根据权利要求1所述的检测载脂蛋白M基因敲除小鼠基因型的方法，其特征在于：实时荧光定量PCR反应体系如下：
DNA模板2μL；
野生纯合型上游引物（100μM）0.1μL；
野生纯合型下游引物（100μM）0.1μL；
野生纯合型探针（100μM）0.1μL；
敲除纯合型上游引物（100μM）0.1μL；
敲除纯合型下游引物（100μM）0.1μL；
敲除纯合型探针（10...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗光华，郑璐，于洋，
申请(专利权)人：常州市第一人民医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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