具有过氧合酶活性的多肽制造技术

本发明专利技术涉及具有过氧合酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。编码过氧合酶的多核苷酸分离自条纹拟盘多毛孢。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对序列表的引用本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。背景专利
本专利技术涉及具有过氧合酶(peroxygenase)活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及核酸构建体、载体以及包括这些多核苷酸的宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。相关技术说明WO 2006/034702 A1披露了使用茶树菇TM A1的AaP过氧合酶来酶促羟基化未活化的烃(例如，萘、甲苯和环己烷)的方法。这也描述于乌尔里克(Ullrich)和霍夫里克特(Hofrichter)，2005，欧洲生化学会联合会快报(FEBS Letters)579:6247-6250中。DE 103 32 065A1披露了用于通过使用茶树菇TM A1的AaP过氧合酶通过醛的中间形成从醇中酶法制备酸的方法。报道了用于通过该AaP过氧合酶而快速和选择性地以分光光度计直接检测芳香族羟基化的方法(克卢格(Kluge)等人，2007，应用微生物学和生物技术(Appl Microbiol Biotechnol)75:1473-1478)。从嗜粪真菌辐毛鬼伞(Coprinus radians)中分离了另一种能够进行芳香族过氧合化(peroxygenation)的过氧合酶并对其进行了表征，鉴定了N-末端16个氨基酸并与较早公布的茶树菇的AaP酶的N-末端14个氨基酸进行了比对；但是未分离编码基因(安赫(Anh)等人，>2007，应用与环境微生物学(Appl Env Microbiol)73(17):5477-5485)。WO 2008/119780披露了若干种不同的过氧合酶多肽及其编码多核苷酸连同其重组产生。WO 2011/120938披露了使用过氧合酶多肽的脂肪烃的位点特异性羟基化。本专利技术提供了具有过氧合酶活性的新颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。专利技术概述本专利技术涉及具有过氧合酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％的序列一致性；(b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交；(c)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或其cDNA序列具有至少60％序列一致性；(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有过氧合酶活性。本专利技术还涉及编码本专利技术的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。本专利技术还涉及使用本专利技术的多肽的方法。本专利技术还涉及一种编码信号肽的多核苷酸，该信号肽包括SEQ ID NO:2的氨基酸-20至-1或由其组成，该多核苷酸被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；以及产生一种蛋白质的方法。定义过氧合酶(Peroxygenase)：术语“过氧合酶”意指根据EC 1.11.2.1的一种“非特异性过氧合酶”活性，其催化来自H2O2的一个氧原子插入多种底物(例如硝基苯并二噁茂)中。出于本专利技术的目的，过氧合酶活性是根据描述于实例2，或描述于以下中的程序确定的：M.波拉杰-可比尔斯考(Poraj-Kobielska)，M.金尼(Kinne)，R.乌尔里克(Ullrich)，K.诗切布内尔(Scheibner)，M.霍夫里克特(Hofrichter)，“用于检测真菌过氧合酶的分光光度计测定(A spectrophotometric assay for the detection of fungal peroxygenases)”，分析生物化学(Analytical Biochemistry)(2012)，第421卷，第1期，第327–329页。在一个方面中，本专利技术的这些多肽(过氧合酶)具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的过氧合酶活性。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。片段：术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有过氧合酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严谨度条件、中‑高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体；(c)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有过氧合酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.10.12 EP 12188458.91.一种具有过氧合酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，
该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少
60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、
至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、
至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严
谨度条件、中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下
与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA
序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体；
(c)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ 
ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至
少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至
少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至
少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个
位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有过氧合
酶活性。
2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括一个氨基酸序列，该氨
基酸序列包括以下基序：
E-H-D-[G,A]-S-[L,I]-S-R、或
R-[G,A]-P-C-P-X-[M,L]-N-[S,T]-L。
3.如权利要求1或2所述的多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟
多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至
少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至
少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一

\t致性。
4.如权利要求1-3中任一项所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编
码，该多核苷酸在低严谨度条件、低-中严谨度条件、中严谨度条件、
中-高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项
杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或
(iii)(i)或(ii)的全长互补体。
5.如权利要求1-4中任一项所述的多肽，该多肽由以下多核苷酸编
码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列
具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、
至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、
至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性。
6.如权利要求1-5中任一项所述的多肽，该多肽包括SEQ ID NO:2
或SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其组成。
7.如权利要求6所述的多肽，其中该成熟多肽是SEQ ID NO:2的
氨基酸1至246。
8.如权利要求1-5中任一项所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2
的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失
和/或插入。
9.如权利要求1所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO:2的一个片段，
其中该片段具有过氧合酶活性。
10.一种包括如权利要求1-9中任一项所述的多肽的组合物。
11.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-9中任
一项所述的多肽。
12.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括
如权利要求11所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多
肽在一个表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。
13.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求11所
述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个
或多个控制序列。
14.一种产生如权利要求1-9中任一项所述的多肽的方法，该方
法包括：
(a)培养一种细胞，该细胞以其野生型形式在有益于产生该多肽
的条件下产生该多肽；并且
(b)回收该多肽。
15.一种产生具有过氧合酶活性的多肽的方法，该方法包括：
(a)在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求13所述的宿
主细胞；并且
(b)回收该多肽。
16.用一种多核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·兰德维克，L·H·厄斯特高，L·卡卢，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK