用于治疗遗传性病状的方法和组合物技术

本文提供用于遗传性疾病的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2012年8月29日提交的美国临时申请号61/694,693的权益，所述临时申请的公开内容特此以全文引用的方式并入。
本公开属于造血干细胞的基因组工程领域，尤其是用于治疗血红蛋白病。背景基因疗法对于人类医学的新时代保持巨大的潜力。这些方法将允许治疗迄今尚未被标准的医学实践解决的病状。特别有前途的一个领域是对细胞进行基因工程改造以使得该细胞表达先前没有在该细胞中产生的产物的能力。这种技术的用途的实例包括插入编码新治疗蛋白的基因、插入编码在细胞中或个体中缺乏的蛋白的编码序列、在含有突变基因序列的细胞中插入野生型基因，和插入编码结构核酸例如微RNA或siRNA的序列。转基因可以通过多种方式递送至细胞，以使得转基因整合至细胞自身的基因组中并且保持在其中。近年来，已开发了转基因整合策略，其使用位点特异性核酸酶裂解以靶向插入至所选基因组基因座中(参见例如共同拥有的美国专利7,888,121)。可利用对靶向基因具有特异性的核酸酶以使得转基因构建体通过同源介导的修复(HDR)插入或在非同源末端接合(NHEJ)驱动的方法期间通过末端捕捉插入。靶向基因座包括“安全港”基因座，例如CCR5基因、CXCR4基因、PPP1R12C(也称为AAVS1)基因、白蛋白基因或Rosa基因。参见例如美国专利公布号20080299580；20080159996；201000218264；20110301073；20130177983和20130177960以及美国临时申请号61/823,689。与依赖于转基因的随机整合的经典的整合方法相比，核酸酶介导的整合提供改进的转基因表达、增加的安全性和表达持久性的前景，因为它允许精确的转基因定位，使得基因沉默或附近致癌基因活化的风险最小。红血细胞(RBC)或红细胞是血液的主要细胞组分。实际上，RBC在人类中占细胞的四分之一。人类中的成熟RBC没有细胞核和许多其它细胞器，并且全部是血红蛋白，血红蛋白是存在于RBC中的金属蛋白，其功能是携带氧气至组织以及携带二氧化碳离开组织并返回到肺部以去除。所述蛋白构成RBC干重的约97％并且它使血液的携氧能力提高约70倍。血红蛋白是包含两条α样珠蛋白链和两条β样珠蛋白链和4个血红素基团的异四聚体。在成人中，α2β2四聚体被称为血红蛋白A(HbA)或成人血红蛋白。通常，α和β珠蛋白链以近似1:1比率合成并且这个比率在血红蛋白和RBC稳定化方面似乎是关键的。实际上，在一类珠蛋白基因不足表达的一些情况下(参见下文)，降低另一类型的珠蛋白的表达(例如使用特异性siRNA)，从而恢复这种1:1比率，减轻了突变细胞表型的一些方面(参见Voon等,(2008)Haematologica 93(8):1288)。在发育中的胎儿中，产生不同形式的血红蛋白(胎儿血红蛋白(HbF))，其相比于血红蛋白A对氧具有更高的结合亲和力，以使得氧可经由母体血流递送至婴儿系统。胎儿血红蛋白也含有两条α珠蛋白链，但代替成人β珠蛋白链，其具有两条胎儿γ珠蛋白链(即，胎儿血红蛋白是α2γ2)。在妊娠约30周时，胎儿中γ珠蛋白的合成开始下降，而β珠蛋白的产生增加。至大约10月龄时，新生儿的血红蛋白几乎全部是α2β2，但一些HbF持续到成年期(总血红蛋白的约1-3％)。从产生γ至产生β的开关的调节相当复杂，并且主要涉及γ珠蛋白的表达下调与β珠蛋白表达的同时上调。在编码血红蛋白链的序列中的遗传缺陷可造成多种疾病，称为血红蛋白病，包括镰状细胞贫血和地中海贫血。在大多数患有血红蛋白病的患者中，仍存在编码γ珠蛋白的基因，但由于如上所述在围产期发生的正常基因抑制，表达相对较低。据估计，在美国有1/5000的人群患有镰状细胞疾病(SCD)，大多是撒哈拉以南非洲裔人群。镰状细胞杂合性似乎对于防止疟疾存在益处，因此这种特性可能已经随着时间推移经过选择，使得据估计在撒哈拉以南非洲，有三分之一的人口具有镰状细胞特性。镰状细胞疾病是由β珠蛋白基因中的突变造成，其中氨基酸#6的谷氨酸被缬氨酸取代(在DNA水平上是GAG至GTG)，其中所产生的血红蛋白被称为“血红蛋白S”或“HbS”。在较低氧条件下，HbS的脱氧形式的构象转变暴露出蛋白上E与F螺旋之间的疏水补丁。血红蛋白中β链位置6的缬氨酸的疏水残基能够与所述疏水补丁缔合，造成HbS分子聚集并形成纤维状沉淀物。这些聚集体又造成RBC的异常或‘镰状化’，导致细胞的柔性损失。镰状化RBC不再能够挤入毛细血管床中并且可以导致镰状细胞患者中的血管闭塞性危机。另外，镰状RBC比正常RBC更脆弱，并且易于溶血，最终导致患者中出现贫血。镰状细胞患者的治疗和管理是终身主张，涉及抗生素治疗、疼痛管理和在急性发作期间的输血。一种方法是使用羟基脲，其通过增加γ珠蛋白产生而部分地发挥其作用。然而，长期羟基脲疗法的长期副作用仍然未知，并且治疗引起不希望的副作用并且在不同患者之间可能具有可变的功效。尽管镰状细胞治疗的功效增加，但患者的预期寿命仍然仅为55至59岁并且疾病的相关发病率对患者的生活质量具有深远的影响。地中海贫血也是与血红蛋白有关的疾病并且通常涉及珠蛋白链的表达降低。这可以通过基因的调节区域中的突变或由导致表达降低的珠蛋白编码序列中的突变发生。α地中海贫血与西非和南亚裔人群有关，并且可能赋予抗疟疾性。β地中海贫血与通常来自希腊以及土耳其和意大利的沿海地区的地中海裔人群有关。地中海贫血的治疗通常涉及输血和铁螯合疗法。如果可以鉴定适当的供体，则骨髓移植也被用于治疗患有严重地中海贫血的人，但这种程序可能具有显著风险。已提出的一种用于治疗SCD和β地中海贫血的方法是增加γ珠蛋白的表达，目的在于用HbF在功能上替换异常成人血红蛋白。如上所述，用羟基脲治疗SCD患者被认为是成功的，这在一定程度上是由于其对于增加的γ珠蛋白表达的影响。发现影响HbF再激活活性的第一组化合物是细胞毒性药物。在实验动物中使用5-氮杂胞苷首次显示通过药理操纵重新合成γ珠蛋白的能力(DeSimone(1982)Proc Natl Acad Sci USA 79(14):4428-31)。后续研究证实5-氮杂胞苷在具有β地中海贫血和镰状细胞疾病的患者中增加HbF的能力(Ley等,(1982)N.Engl.J.Medicine，307:1469-1475；和Ley等,(1983)Blood62:370-380)。另外，短链脂肪酸(例如丁酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种锌指蛋白，其包含4、5或6个包含识别螺旋区域的锌指结构域，其中所述锌指蛋白包含以表1的单行所示顺序的所述识别螺旋区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.29 US 61/694,6931.一种锌指蛋白，其包含4、5或6个包含识别螺旋区域的锌指结构域，
其中所述锌指蛋白包含以表1的单行所示顺序的所述识别螺旋区域。
2.一种融合蛋白，其包含权利要求1的锌指蛋白和野生型或工程改造的
裂解结构域或野生型或工程改造的裂解半结构域。
3.一种多核苷酸，其编码一种或多种权利要求1或权利要求2的蛋白。
4.一种分离细胞，其包含一种或多种根据权利要求2的融合蛋白或一种
或多种根据权利要求3的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述细胞选自由红血细胞(RBC)
或前体细胞组成的组。
6.根据权利要求5所述的细胞，其中所述前体细胞是CD34+造血干细胞。
7.一种试剂盒，其包含根据权利要求1或权利要求2的蛋白或根据权利
要求3的多核苷酸。
8.一种改变细胞中的珠蛋白基因表达的方法，所述方法包括：
在一定条件下向所述细胞中引入一种或多种根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷戈里·J·科斯特，菲利普·D·格雷戈里，德米特里·格斯钦，迈克尔·C·福尔摩斯，杰弗里·C·米勒，戴维·帕绍恩，爱德华·J·雷巴尔，安德里亚斯·赖克，费奥多·乌尔诺夫，张雷，
申请(专利权)人：桑格摩生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US