本发明专利技术的启动子优化的慢病毒表达体系其特征在于采用了MSCV启动子，该启动子优化的慢病毒表达体系基因修饰T细胞使之表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)，其特征在于：在多克隆位点顺序插入TCRα、furin间隔序列、2A肽、TCRβ序列；启动子优化的慢病毒载体构建的嵌合型抗原受体(CAR)表达载体其特征在于：在多克隆位点插入CAR序列。本发明专利技术重组慢病毒载体的应用，如使重组TCR表达在T细胞，及通过CAR表达在T或NK细胞以达到特异性杀伤肿瘤的目的，并可以应用到临床的肿瘤治疗中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于利用慢病毒技术基因修饰T及NK细胞并使之获得稳定的特异性抗肿 瘤能力的一种基因修饰技术，属于第四代特异性抗肿瘤免疫治疗技术，是近年来肿瘤免疫 治疗技术的一个热点，在肿瘤治疗（包括白血病）上取得了突破性进展（Lee，Kochenderfer et al. 2014, Maude, Frey et al. 2014) 〇
技术介绍
恶性肿瘤是最为严重危害人类健康的疾病，每年中国大约三百万人被诊断为新 发肿瘤患者，二百万人死于癌症。尽管可以通过手术、放疗、化疗进行治疗，但大多数病人 不能承受治疗毒副作用和治疗效率，仍死于肿瘤的复发和转移。所以，如何清除残留的微 小肿瘤组织或肿瘤细胞则是现代肿瘤免疫学有待解决的问题之一。由于癌症发生的根本原 因是肿瘤细胞逃逸免疫细胞的监控而进行无节制的生长，所以提高免疫系统识别和杀伤肿 瘤细胞将从可以根本上去除肿瘤。目前，免疫疗法是国际公认的最有希望完全消灭肿瘤细 胞的第四大新的治疗方法。"癌症免疫疗法"被美国《科学》杂志评为2013年最大的科学突 破。免疫疗法逐渐成为治疗癌症最有效的方法之一。 同西方发达国家正在澎湃发展的第四代肿瘤特异性免疫治疗技术相比，我国目前 的免疫治疗还停留在第二代和第三代非特异性免疫治疗阶段。第四代免疫技术的主要技术 依托是基因修饰技术，目前，我国基因修饰技术同西方发达国家相比严重滞后，缺乏可以提 供基因工程病毒载体制备的服务机构及技术支持，更缺乏相关法规来指导临床的应用。令 人欣喜的是，我国对肿瘤免疫治疗非常重视，也有越来越多的科研院所，企业投入人力，资 金加入该邻域的研发及临床应用；但是，缺乏基因修饰手段成了制约免疫细胞治疗升级换 代的首要因素。 目前国际上最流行的可以稳定整合免疫细胞的病毒载体是LENTIVIRALVECTOR (慢 病毒载体体系），已在欧美发达国家进行了大量的临床试验，是公认安全，高效基因转导系 统。如前所述，以抗肿瘤TCR及CAR T技术为代表的基因修饰技术给肿瘤的治疗带来了崭 新的方法学，并引发了肿瘤治疗史上的重大突破，2013年更被多家权威杂志列为年度科技 突破。其所需要的基因修饰既由该基因修饰载体来完成，已经进行了大量的人体实验，其中 有的实验治疗者已经平安的度过了 20余年，没有发现任何毒副作用。 本专利技术所应用的慢病毒属于最新一代载体系统，由四个功能组分构成，最大程度 地降低了其重组的可能性。在改造的慢病毒体系中，为了有效地表达目的基因，需要加入 一个有效的启动子，其功能是启动目的基因在宿主细胞内表达。目前，比较流行的启动子 是 CMV (Human cytomegalovirus)UBC (Ubiquitin)、PGK(phosphoglycerate kinase-1)、 EF1 (elongation factor-lalpha)等，但它们在T及NK细胞内的表达不够持久、效率低、容 易被甲基化从而失去功能。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题而提出的。本专利技术系统地比较了不同的启动 子，并进行了优化性构建，筛选出了最适合在人类T及NK细胞内表达的MSCV启动子（鼠干 细胞病毒启动子），该启动子比较其它启动子具有高效，稳定长期表达的优越性，是一种非 常有临床应用前景的基因修饰体系。另外，为了达到高效均衡地表达抗肿瘤受体（TCR)的 两条链（a和0)，该专利技术亦优化了病毒来源的2A结构，既优化地构建了 Furin+SGSG+2A 链接体，最大化地并均衡地表达抗肿瘤TCR的两条链，经基因修饰的T细胞可以特异性识别 表达特异性抗原的肿瘤细胞，并高效率、特异性地杀伤肿瘤，实现了抗肿瘤效果的最大化。 鉴于基因修饰的T细胞表达的抗肿瘤TCR存在主要组织相容性复合体限制 性（MHC)的问题，既一种抗肿瘤TCR只能应用到一类特定的人群（Morgan, Dudley et al. 2006)，专利技术人进一步应用该启动子优化的慢病毒表达载体基因修饰T、NK细胞，使之表 达CAR的结构，并证实经基因修饰的T、NK细胞可以特异性地识别表达相应肿瘤抗原的靶细 胞，包括肿瘤细胞。 本专利技术主要包括： 1.优化慢病毒启动子，比较了 MSCV，PGK，UBC等启动子在原代T细胞及NK细胞 上的表达效率，实验证实MSCV启动子优化的慢病毒体系是基因修饰T、NK细胞的最佳方案 (见图1-2); 2.优化构建表达TCR两条链的2A链接体，并在T细胞表面高效表达，同时可以特 异性识别并有效杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞（见图3-6); 3. MSCV启动子优化的慢病毒体系可以在T细胞高效表达抗肿瘤嵌合性抗原受体 (CAR)，并可以特异性识别表达相应靶点的肿瘤细胞（见图7-9); 4. MSCV启动子优化的慢病毒体系可以高效基因修饰NK细胞（见图10)。 本专利技术提供了一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。 本专利技术还提供了一种以上述抗肿瘤T细胞为活性成分的抗肿瘤药物。 为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案： 本专利技术的第一个方面是提供一种抗肿瘤T细胞，其特征在于，所述抗肿瘤T细胞是 以启动子优化的慢病毒表达载体基因修饰T及NK细胞表达抗肿瘤TCR和抗肿瘤CAR来实 现的。 在上述抗肿瘤T细胞中，所述T及NK细胞来自人类的外周血单个核淋巴细胞。 本专利技术的第二个方面是提供如上述抗肿瘤T细胞的制备方法，包括如下步骤： 步骤1、包涵抗肿瘤TCR和抗肿瘤CAR的启动子优化的慢病毒载体的制备：通过 基因克隆，把TCR和CAR克隆到以MSCV为启动子的慢病毒的多克隆位点，应用第四代慢病 毒的四个包装质粒，通过转染293FT细胞包装成具有一次转导能力的基因工程载体来实现 的； 步骤2、T及NK细胞的转导：将步骤1得到的包涵TCR和CAR的基因工程载体转 导体外培养的T及NK细胞。T细胞的转导：T细胞经抗一⑶3/⑶28磁珠激活并过夜培养， 然后滴加包涵TCR的载体，连续培养14天，期间按细胞生长情况分瓶及补充新鲜液体；包涵 CAR的载体转导T细胞与上述方法相同，但T细胞的激活采取可溶性抗一 CD3抗体，其目的 是达到最大的感染效率。NK细胞通过抗CD56磁珠分选后，应用包含CAR的基因工程载体转 导NK细胞，并加入KT64 (K562基因修饰的细胞株）进行扩增。 步骤3、将步骤2所得到的T及NK细胞经过14天的体外培养，得到如权利要求1 所述的抗肿瘤T细胞。 本专利技术的第三个方面是提供一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物以权利要求1所述 的抗肿瘤T细胞为活性成分。 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述抗肿瘤药物为药剂。 在上述抗肿瘤药物中，优选地，所述肿瘤包括例如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌。【附图说明】 图1改造后的慢病毒表达载体系统结构示意图。第四代慢病毒载体的结构如图所 示，该载体两末端的LTR经过基因工程改造，既改造成失活LTR，大大地增加了其安全性。启 动子标识包括了 MSCV，PGK及UBC，启动子之后的序列为绿色荧光蛋白（GFP)。 图2如图1所示的装有GFP的慢病毒转导T细胞。两例来自PBMC的T细胞体外 经抗CD3抗体活化后，应用上述病毒基因修饰T细胞，3天后，利用流式细胞仪检测GFP在T 细胞的荧光强度，流式检测结果显示启动子的表达活性M本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种启动子优化的慢病毒载体，其特征在于：采用MSCV启动子。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨世成，
申请(专利权)人：深圳市中美康士生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。