一种基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其是在稀释的单链核酸探针溶液中先后加入硝酸银溶液，冰上孵育后，再加入硼氢化钠溶液，先得到DNA-银纳米簇溶液；在460～470nm条件下检测DNA-银纳米簇溶液在加入中药单体前后的荧光强度，若加入中药单体后荧光强度降低，则说明该中药单体可以诱导DNA-银纳米簇的端粒识别序列形成G-四链体结构，该中药单体为G-四链体配体；否则，相反，从而实现G-四链体配体的均相筛选。本发明专利技术的筛选方法具有操作简便、响应快速、灵敏可靠、普适性强、易于推广而且成本较低的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于抗肿瘤药物筛选的
，特别涉及一种基于DNA-银纳米簇均相 筛选G-四链体配体的方法。
技术介绍
端粒是由端粒DNA和端粒结合蛋白构成的。端粒DNA是位于染色体末端并对染 色体具有保护作用的富含鸟嘌呤（G)的DNA重复序列，它由富GT链与富CA链配对的双螺 旋结构和一段3'末端悬突的富G单链的重复序列组成，人类端粒DNA为5' -TTAGGG-3' 重复序列。端粒酶是一种依赖于RNA的特殊聚合酶，由逆转录酶催化亚基（hTERT)、端粒 酶RNA和端粒酶其他聚合蛋白组成。端粒酶能以自身的RNA作为模板，在染色体末端合成 端粒序列，从而保持端粒长度稳定，使细胞永生化。研宄发现，端粒酶在正常体细胞中几 乎没有表达，但是在85%以上的癌症细胞中，端粒酶却呈阳性表达，而且进一步的研宄说 明，肿瘤细胞分化程度与端粒酶的活性直接相关，这表明端粒酶与肿瘤细胞的恶性转化及 快速增殖可能存在密切的关系（Shay J.W., Wright W.E.Telomerase therapeutics for cancer:challenges and new directions. Nat. Rev. Drug Discov.2006, 5:577 - 584.), 因此恶性肿瘤与端粒酶的活性之间具有高度的相关性。 富含G的端粒DNA单链在K+、Na+等离子以及一些药物分子的存在下可以通过G碱 基之间的Hoogsteen环状氢键形成稳定的G-四链体结构（Hupper J. L. , Balasubramanian S.Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic. Acids. Res. 2005, 33(9) : 2908 - 2916.)。G-四链体的形成可以阻止端粒酶对端粒DNA序列的识别， 从而抑制端粒酶的活性。端粒酶活性的抑制可使肿瘤细胞端粒缩短直至细胞停止增殖，转 入细胞凋亡过程，从而抑制肿瘤的发展。因此这一发现使G-四链体成为端粒酶抑制剂作用 的新靶点，对于能够诱导形成或增强G-四链体稳定性的小分子化合物则很有可能对癌症 的治疗具有潜在的意义。 在已报道的研宄工作中，X-射线衍射、表面等离子体共振（SPR)、核磁共振（NMR)、 等温滴定量热法（ITC)、电喷雾质谱法（ESI-MS)、凝胶电泳等多种分析方法被用来研宄 G-四链体及其配体的筛选。但是现在常用的方法均存在操作复杂，费时，成本较高、所要求 的实验条件较为苛刻等不足，因此，探寻一种低成本、简单操作且结果可靠的G-四链体及 配体的筛选方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服已有的技术的缺点，构建一种普适性强、低成 本、响应快速、灵敏可靠的基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法。 为了解决上述技术问题本专利技术所采用的技术方案是由下述步骤组成： (1)用10mm〇l/LpH = 8.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将单链核酸探针 配制为100 y mol/L的储备液备用，该单链核酸探针的序列为：5'-CCCCCCCCCCCCTTTTTTTA GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'，再用相同方法将100 y mol/L单链核酸探针储备液浓度稀释 后加入原浓度为10mm〇l/L的硝酸银溶液，冰上孵育10~15分钟，再加入原浓度为lOmmol/ L的硼氢化钠溶液，使单链核酸探针在终混合液中的浓度达到20 y mol/L，单链核酸探针与 硝酸银、硼氢化钠的终浓度之比为1:5:5~1:12:12,混匀至反应完全，得到DNA-银纳米簇 溶液； (2)用10mm〇l/L pH = 8. 0三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将DNA-银纳米簇溶 液的浓度稀释至1. 0 U mol/L，在激发波长为460~470nm条件下检测其初始焚光值，并记录 为F〇; (3)在步骤⑵的基础上加入中药单体溶液至中药单体在混合液中的最终浓度达 到20 ymol/L，混匀，待反应完全后在与步骤（2)相同的激发波长条件下检测其反应后的荧 光值，并记录为F ;若荧光强度值降低，则表明该中药单体可以诱导DNA-银纳米簇的端粒识 别序列形成G-四链体结构，该中药单体为G-四链体配体；若否，则相反，其不属于G-四链 体配体，从而实现G-四链体配体的均相筛选。 上述步骤（1)中单链核酸探针与硝酸银、硼氢化钠的终浓度比为1 :6 :6。 上述步骤（3)筛选的G-四链体配体为芦荟大黄素衍生物3、白杨素、大豆苷元、槲 皮素、大黄素、芦荟大黄素、山奈酚、大黄酚、芹菜素以及木犀草素的中药单体。 上述单链核酸探针是由5'末端12个胞嘧啶、3'末端d(TTAGGG)4以及5个胸腺 嘧啶相链接构成。 本专利技术提供的一种基于DNA银纳米簇均相筛选G-四链体配体的方法，其基于富G 单链和G-四链体对DNA-银纳米簇荧光信号具有不同的影响，结合人类端粒DNA本身就是 富G序列，通过端粒DNA与其配体相互作用前后由单链转化为四链体构型进而引起银纳米 簇荧光信号的变化均相筛选G-四链体配体，本专利技术的方法具有操作简便、响应快速、灵敏 可靠、普适性强、易于推广而且成本较低的特点，而且通过细胞荧光成像实验和MTT细胞增 殖实验进一步验证本专利技术的方法所筛选出G-四链体配体的确可以抑制癌细胞的生长，其 对于以G-四链体为靶点的小分子端粒酶抑制剂的研宄和抗肿瘤药物的开发、肿瘤的临床 治疗等具有重要的理论意义和实际意义。【附图说明】 图1为合成的5. 0 y mol/L DNA-银纳米簇的透射电子显微镜结果； 图2为1. 0 y mol/L DNA-银纳米簇的激发和发射光谱图； 图3为1. 0 ymol/L DNA-银纳米簇与10 ymol/L芦荟大黄素衍生物3(AED3)作用 前后的荧光激发和发射光谱对比图； 图4为l.Oymol/LDNA-银纳米簇与10ym〇l/L苦参碱作用前后的荧光激发和发 射光谱对比图； 图5为不同中药单体作用于DNA-银纳米簇后荧光信号变化的柱状图，匕代表单独 DNA-银纳米簇的信号，F代表加入中药单体后的荧光信号；图6为人端粒DNA分别与芦荟大黄素衍生物3和苦参碱作用后的圆二色光谱图。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术不限于这些实施例。 实施例1 以芦荟大黄素衍生物3 (AED3)为例，筛选其是否为G-四链体配体的方法由以下步 骤组成： (1)按照常规方法制得浓度为10mm〇l/LpH=8.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓 冲溶液，用该缓冲溶液将单链核酸探针（12C5TG，序列为：5' -CCCCCCCCCCCCTTTTTTTAGGGT TAGGGTTAGGGTTAGGG-3')配制成浓度为 100 y mol/L 的储备液，备用；向 155. 2 y L lOmmol/ LpH=8.0三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液中加入40 y L 100 ymol/L单链核酸探针储 备液，向单链核酸探针稀释液中加入2. 4 y L 10mm〇l/L硝酸银溶液，冰上孵育15分钟，快速 向以上混合溶液中加入2. 4 y L 10mmol/L硼氢化钠，使单链核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DNA银纳米簇均相筛选G‑四链体配体的方法，其特征在于由以下步骤组成：(1)用10mmol/L pH＝8.0的三羟甲基氨基甲烷‑醋酸缓冲溶液将单链核酸探针配制为100μmol/L的储备液备用，该单链核酸探针的序列为：5′‑CCCCCCCCCCCCTTTTTTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG‑3′，再用相同方法将100μmol/L单链核酸探针储备液浓度稀释后加入原浓度为10mmol/L的硝酸银溶液，冰上孵育10～15分钟，再加入原浓度为10mmol/L的硼氢化钠溶液，使单链核酸探针在终混合液中的浓度达到20μmol/L，单链核酸探针与硝酸银、硼氢化钠的终浓度之比为1:5:5～1:12:12，混匀至反应完全，得到DNA‑银纳米簇溶液；(2)用10mmol/L pH＝8.0三羟甲基氨基甲烷‑醋酸缓冲溶液将DNA‑银纳米簇溶液的浓度稀释至1.0μmol/L，在激发波长为460～470nm条件下检测其初始荧光值，并记录为F0；(3)在步骤(2)的基础上加入中药单体溶液至中药单体在混合液中的最终浓度达到20μmol/L，混匀，待反应完全后在与步骤(2)相同的激发波长条件下检测其反应后的荧光值，并记录为F；若荧光强度值降低，则表明该中药单体可以诱导DNA‑银纳米簇的端粒识别序列形成G‑四链体结构，该中药单体为G‑四链体配体；若否，则相反，其不属于G‑四链体配体，从而实现G‑四链体配体的均相筛选。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金燕，成锐，张琦，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61