牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针制造技术

本发明专利技术公开了一种牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和探针。用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，是根据牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的。本发明专利技术可方便高效地检出牛棒状杆菌，具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中细菌的分子生物学检测方法和试剂盒，特别是涉及牛 棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。
技术介绍
牛棒状杆菌（Corynebacterium bovis, Cb)属于棒状杆菌科 (Corynebacteriaceae)，棒状杆菌属（Corynebacterium)，是一种革兰氏阳性棒状杆菌。主 要引起奶牛的乳房炎和肾盂肾炎，在实验动物中，能够感染小鼠和大鼠，特别是裸鼠等免疫 缺陷动物。 免疫缺陷动物是重要的动物模型，是研宄免疫学、肿瘤学的重要工具。随着免疫缺 陷动物在临床研宄中的广泛应用，牛棒状杆菌感染的情况屡见不鲜。感染后会使动物皮肤 出现鳞肩，精神萎靡，严重影响研宄的进行。 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累 实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合 了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时 荧光定量检测系统。实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出。 焚光探针技术是根据标记基团的焚光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。当某个焚光基团的发射光谱与另一个焚光基团的 吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到 长波长（低能量）的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为 FRET〇 实时荧光定量PCR技术的常见机制包括荧光染料检测和水解探针检测。TaqMan 探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡 核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射 的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' -3'外切酶活性将探针酶切降解，使 报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。与普通 TaqMan探针法相区别，TaqMan MGB(Minor Groove Binder)探针法同时将小沟结合物（MGB) 连接到探针上，可以将探针的温度提高10°c左右，为了获得同样的退火温度（Tm值），MGB探 针可以比普通TaqMan探针设计的更短。不仅降低了合成的成本，也提高了探针的设计成功 率。目前对牛棒状杆菌仍然缺乏全面系统的研宄，当务之急是首先建立该病原菌的快 速检测方法，及时发现，及时采取措施，避免或减少其对科学研宄的影响，对保障免疫学、月中 瘤学等动物实验数据的准确、可靠具有极其重要的意义。
技术实现思路
本专利技术了用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，以实现牛棒状杆菌的批 量检测，提高检测的灵敏度、特异性和稳定性。 本专利技术所提供的用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，是根据牛棒状杆 菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的，用以定量检测牛棒状杆菌、动物及相关生物制品 中的牛棒状杆菌核酸拷贝数，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO. 1所示 的寡核苷酸序列。 具体而言，所述引物中的上游引物优选具有SEQ ID NO. 2所示序列的寡核苷酸序 列，下游引物优选具有SEQ ID NO. 3所示序列的寡核苷酸序列。 本专利技术的另一目的是提供一种用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR TaqMan MGB探针，该探针是根据牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的，所述的牛棒状 杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO. 1所示的寡核苷酸序列。 具体而言，本专利技术所述的TaqMan MGB探针优选具有SEQ ID NO. 4所示序列的寡核 苷酸序列，且其5'端标记有报告荧光基团，3'端标记有淬灭荧光基团。 所述报告荧光基团优选为羧基荧光素（FAM)，所述的荧光淬灭基团优选为NFQ (无 荧光猝灭基团）。 本专利技术也提供了一种用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括 上述用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物和TaqMan MGB探针。 所述试剂盒包括以下用于20 y L反应体系的试剂：TaqMan Mix 10 y 1，上游引物 5pmol，下游引物 5pmol，TaqMan MGB 探针 2. 5pmol。 为了方便检测，所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含 有牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的质粒，所述阴性对照为不含牛棒状杆菌 16SrRNA V3区基因的保守区域的扩增体系，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO. 1所示的寡核苷酸序列。 本专利技术还提供了上述引物、探针或试剂盒在牛棒状杆菌实时荧光定量PCR检测中 的应用。 具体而言，所述的应用，包括如下步骤： (1)标准曲线的绘制：以含有牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域的质粒为 标准品，将其进行系列稀释，将所述质粒作为模板，进行实时荧光定量PCR检测，得到用于 牛棒状杆菌检测的标准曲线； ⑵待测样品的检测：以待测样品基因组DNA作为模版，采用和标准品相同的反应 体系和反应条件，进行实时荧光定量PCR检测； (3)反应结束后，根据标准曲线计算出待测样品中牛棒状杆菌的拷贝数。根据所得 待测样品反应的Ct值（Y)，带入标准曲线公式Y = -3. 494X+40. 686,可计算得到待测样品 中牛棒状杆菌的原始拷贝数的对数（X)，即得到待测样品中牛棒状杆菌的拷贝数。 本专利技术具有以下优点： 1、建立了牛棒状杆菌探针法荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以对病原 微生物、动物的组织样品及相关生物制品进行牛棒状杆菌核酸的定量检测。 2、本检测方法与牛棒状杆菌的其它常规检测方法如细菌的分离培养及生化鉴定 和普通PCR相比，灵敏度较高，比普通P当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测牛棒状杆菌的实时荧光定量PCR引物，是根据牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因的保守区域设计的，所述的牛棒状杆菌16SrRNA V3区基因具有SEQ ID NO.1所示的寡核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢进，冯育芳，岳秉飞，贺争鸣，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11