羟丙基壳聚糖取代度的测定方法技术

本发明专利技术公开了一种吸光光度法测羟丙基壳聚糖取代度的方法，其特征是：A.制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应关系曲线；B.用吸光光度值检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值；根据上一步骤制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测羟丙基壳聚糖水解产生的相当于丙二醇的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量。本发明专利技术中关键参数如反应温度、反应时间、检测波长的选择，大大提高了测定的稳定性，使显色产物吸光度值的稳定性由之前已报道的方法中不到0.5小时提高到3小时，使之更便于大批量测定，从而保证实验结果的准确性。

【技术实现步骤摘要】
羟丙基壳聚糖取代度的测定方法
本专利技术涉及的是一种测定羟丙基壳聚糖取代度的方法，具体涉及用吸光光度法测定羟丙基壳聚糖取代度的方法尤其涉及其测定过程中反应温度、反应时间和检测波长的选择。
技术介绍
壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、稳定性、安全性，但其低水溶性大大限制了其在生物制药、废水处理、功能膜材料和纺织等领域的应用。羟丙基化能改善壳聚糖的水溶性，进而提高其在各方面的应用。羟丙基取代度(DS)定义为每个氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖分子上连接的羟丙基的平均数量。取代度的大小决定羟丙基壳聚糖的溶解性、吸湿性、保湿型、成膜性等物化特性及其在医药领域的相关应用，因此取代度的测定方法研究是羟丙基壳聚糖研究中的一项基本工作。目前已报道的用于羟丙基壳聚糖取代度的测定方法有吸光光度法、核磁共振氢谱法、元素分析法，其中吸光光度法成本最低，吸光光度法测羟丙基壳聚糖取代度的原理是利用羟丙基壳聚糖在浓硫酸的作用下醚键、N-C键断裂，羟丙基基团脱落并被氧化为丙醛或丙烯醇，两种化合物均可与茚三酮反应并形成紫色络合物，通过测定此显色产物的吸光度值即可定量计算羟丙基壳聚糖中羟丙基基团的含量，此测定方法的关键在于显色产物的生成及其吸光度值的测定。已报道文献中所用的吸光光度法是直接套用羟丙基淀粉取代度的测定方法，即：将羟丙基壳聚糖与浓硫酸在100℃水浴下反应3min，随即将氧化产物置于冰水浴环境中冷却至10℃以下，加入一定量茚三酮溶液25℃下显色反应100min，显色完成后用浓硫酸定容，于590nm下测定显色产物吸光光度值，同样的操作步骤以丙二醇为底物制作标准曲线，根据标准曲线与羟丙基壳聚糖显色产物吸光度值即可得到羟丙基取代度值。在具体实验中发现按上述操作参数进行实验得到的结果重现性、稳定性较差。首先100℃沸水浴环境不利于人工操作，且此温度下反应产物对反应时间的变化极其敏感，反应时间稍微延长或缩短即会影响反应产物的量(见附图1-3)，这对操作人员在实验中对反应时间的把控要求非常高，极不利于获得准确可靠的实验结果，造成重现性差；另外，590nm检测波长下，显色产物吸光度值极不稳定，随着检测时间的延长，吸光度值呈明显的下降趋势(见附图4-6)，即使两次检测时间间隔20min，吸光度值也会发生较明显的变化，同样不利于获得准确可靠的实验结果，更不利于工业大批量测定。综上所述，现有的吸光光度法在准确度及大规模应用上均存在较大的问题，不利于方法的推广与使用。
技术实现思路
本专利技术的目的为解决现有方法中存在的问题，提供一种利用待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量的取代度测定方法羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量。吸光光度法测定羟丙基壳聚糖取代度包括以下步骤：一种羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征是：A.制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应关系曲线；B.用吸光光度法检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值；C.根据上一步骤制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测羟丙基壳聚糖水解产生的相当于丙二醇的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量。优化的，上述步骤A的具体步骤是：分别取11组具有不同浓度的丙二醇标准溶液0.1mL，浓度范围在0-247μg/mL之间，冰水浴环境中加入0.8mL浓硫酸，混匀，于80℃水浴加热5-8min后立即置于冰水浴冷却，加入0.05mL茚三酮溶液，将0.75g水合茚三酮溶解于50mL12.5％的亚硫酸氢钠水溶液中，混匀，于25℃水浴显色100min后加入1.55mL浓硫酸，充分混匀，于波长540-560nm处测定吸光度值；根据每组丙二醇浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。优化的，上述步骤B的具体步骤是：分别取不同浓度的羟丙基壳聚糖溶液0.1mL，其浓度为0.4-1.2mg/mL，冰水浴环境中加入0.8mL浓硫酸，混匀，于70℃水浴加热1-3min后立即置于冰水浴冷却，加入0.05mL茚三酮溶液，混匀，于25℃水浴显色100min后加入1.55mL浓硫酸，充分混匀，于波长540-560nm处测定吸光度值。根据步骤A制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定羟丙基壳聚糖中羟丙基的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖的取代度；羟丙基壳聚糖的取代度定义为每个氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖分子上所连接的羟丙基的平均数量。优化的，上述丙二醇标准溶液、羟丙基壳聚糖溶液以0.005-0.010mol/L的盐酸溶液为溶剂。优化的，以丙二醇为反应物的反应条件是80℃，6min。优化的，上述以羟丙基壳聚糖为反应物的反应条件是70℃，2min。优化的，上述测定吸光度值的最佳波长范围为550nm-555nm。优化的，步骤C的具体方法是：将步骤B中获得的每个样品浓度的吸光度值代入步骤A中丙二醇浓度与显色产物吸光度值之间的标准对应关系曲线，得到待测羟丙基壳聚糖样品在反应过程中产生的相当于丙二醇的含量，代入以下公式来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量：式中c丙二醇为样品产物吸光度值所对应的丙二醇溶液浓度，μmol/mL；V为该样品溶液的体积，mL；m为样品中羟丙基壳聚糖的质量，mg；58.08、203.19、161.16分别为羟丙基基团、N-乙酰氨基葡萄糖残基、氨基葡萄糖残基的摩尔质量，g/mol；DA为羟丙基壳聚糖中每100个糖残基中所含有的乙酰基个数；0.94为校正系数。有益效果本专利技术的优点首先是优化了反应温度和反应时间，使反应更温和，更容易控制，降低了反应时间对反应目标产物的影响更便于人工操作，提高了测定结果准确度；其次改变了检测波长，使显色产物吸光度值稳定性由之前方法的不到0.5小时提高到3小时，为工业大批量测定创造了极有利的条件。现详述如下：(1)反应温度和反应时间上的有益效果:对于反应物为丙二醇的反应进程而言，如附图7所示，在100℃反应温度下，其产物吸光度值均在反应1-2min时达到最大值，反应时间稍微延长或者缩短均会对目标产物吸光度值造成影响，时间稍长产物即遭到破坏，稍短则反应不完全，因此极不利于大批量样品的准确测定，且沸水浴对于大气压力各异的不同地区而言很难达到相同的沸水温度，不便于方法标准化；而80℃下丙二醇均在反应5-6min时其产物吸光度值达到最大，且最大值可至少维持至8min，在反应时间上，由于产物吸光度值在4-5min仍处于升高状态，为了保证反应完全，避免实验实际操作中在反应时间上可能出现的误差，反应时间设定为6min。而对于反应物为羟丙基壳聚糖的反应进程则不同于丙二醇的情况，如附图8所示，在反应时间均为2min条件下，在100℃反应所得产物的吸光度值明显低于反应温度更低时所测得的吸光度值，这特别体现在高取代度样品上，以70℃为最佳，因其随时间变化较为平稳，特别体现在1-3min之内，如附图9所示，为避免实验操作中因反应时间上可能出现的误差，反应时间设定为2min。(2)检测波长稳定性上的有益效果：如附图10和附图11所示，在550nm测定，该反应产物的吸光度值随时间的变化比在590nm测定的吸光度值明显平稳许多，这为羟丙基壳聚糖的工艺研究以及大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述测定方法的步骤为：A.制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应关系曲线；B.用吸光光度值检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值；C.根据上一步骤制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测羟丙基壳聚糖水解产生的相当于丙二醇的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖中所含的羟丙基含量。

【技术特征摘要】
1.一种羟丙基壳聚糖取代度的测定方法，其特征在于，所述测定方法的步骤为：A.制作以吸光光度法测得的丙二醇氧化产物吸光度值与丙二醇浓度的标准对应关系曲线；所述步骤A的具体步骤是：分别取11组具有不同浓度的丙二醇标准溶液0.1mL，浓度范围在0-247μg/mL之间，冰水浴环境中加入0.8mL浓硫酸，混匀，于80℃水浴加热5-8min后立即置于冰水浴冷却，加入0.05mL茚三酮溶液，将0.75g水合茚三酮溶解于50mL12.5％的亚硫酸氢钠水溶液中，混匀，于25℃水浴显色100min后加入1.55mL浓硫酸，充分混匀，于波长540-560nm处测定吸光度值；根据每组丙二醇浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；B.用吸光光度法检测待测羟丙基壳聚糖水解氧化后产生的相当于丙二醇的吸光度值；所述步骤B的具体步骤是：分别取不同浓度的羟丙基壳聚糖溶液0.1mL，其浓度为0.4-1.2mg/mL，冰水浴环境中加入0.8mL浓硫酸，混匀，于70℃水浴加热1-3min后立即置于冰水浴冷却，加入0.05mL茚三酮溶液，混匀，于25℃水浴显色100min后加入1.55mL浓硫酸，充分混匀，于波长540-560nm处测定吸光度值。根据步骤A制作的丙二醇浓度与测得的氧化产物吸光度值之间的标准对应关系曲线确定羟丙基壳聚糖中羟丙基的含量，以此来计算羟丙基壳聚糖的取代度；羟丙基壳聚糖的取代度定义为每个氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖分子上所连接的羟丙基的平均数量；C.根据上一步骤制作的丙二...

【专利技术属性】
技术研发人员：张永勤，张坤，刘福胜，刘征东，程袁芬，吴国耀，刘均洪，戴圆圆，边文涛，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37